本发明涉及生物技术领域,尤其是一种具有双高特性的链球菌溶血素O蛋白的制备方法,包括以下步骤:1)基因合成;2)载体构建;利用串联重复的SLO蛋白78AA‑571AA进行载体构建;SLO蛋白78AA‑571AA表示SLO蛋白全长序列第78位氨基酸到571位氨基酸,序列如SEQ ID NO:1所示;3)菌种转化;4)链球菌溶血素O蛋白的纯化。本发明方法获得的链球菌溶血素O蛋白SLO简单易纯化、产量高、批间差异小,蛋白稳定性好,反应度高;而且,采用本发明方法分离纯化得到的双高特性的串联的链球菌溶血素O蛋白SLO可用于质控品和校准品的制备,有利于各厂家和实验室的结果比较及质量控制。