本发明公开了一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29DNA聚合酶突变体及其应用,突变体由SEQ ID NO.1所示的Phi29DNA聚合酶中氨基酸突变形成,具体氨基酸突变方式为:M97D,G197A,E221L,G350F,K402L,P428L,K493I,D503I和K512V。本发明的Phi29DNA聚合酶突变体具有9个突变位点,可长期存放于室温条件,与野生型相比,该突变体在DNA扩增反应中具有弱偏好性和更高的反应速率。本发明的Phi29DNA聚合酶突变体作为DNA聚合酶在DNA扩增中的应用,可以催化多重置换扩增,催化滚环复制反应;制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒。