本发明公开了一种鉴定鳅科鱼类的引物、试剂盒以及方法。鉴定引物包括第一引物对和第二引物对,第一引物对的上下游分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列,第二引物对的上下游分别具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。鉴定鳅科鱼类的方法包括:S1:获取鳅科鱼类样品的DNA;S2:用第一引物对对S1中获取的DNA进行PCR扩增,获得第一PCR扩增产物;S3:用第二引物对进行巢氏PCR扩增,以第一PCR扩增产物位模板,获得第二PCR扩增产物;S4:将S3中获得的第二PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,切胶纯化,得到纯化后的第二PCR扩增产物;以及S5:将纯化后的第二PCR扩增产物测序,根据测序结果的碱基序列,在NCBI数据库中比对已知物种鳅科鱼类的线粒体基因序列,确认鳅科鱼类样品的种类。