本发明提出一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用,属于生物技术领域,能够解决现有技术中尚无同时用于检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA‑LFD方法的技术问题。该引物探针组合中的引物分别为BNoV‑F、BNoV‑R和BRV‑F、BRV‑R,BNoV‑F、BNoV‑R和BRV‑F、BRV‑R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27‑28和SEQ ID NO.53‑54所示,所述引物探针组合中的探针为BNoV‑P和BRV‑P,所述BNoV‑P和BRV‑P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59‑60所示。本发明能够从导致犊牛腹泻的病毒中快速、准确地检测出牛诺如病毒和牛轮状病毒,在39℃较低反应温度下反应时间仅需30min,试纸条结果仅需5min即可完成检测。本发明能够应用于基层现场牛诺如病毒和牛轮状病毒的可视化检测方面。