本发明属于新的抗生素替代品技术领域,公开了一种对温度耐受性强的裂解酶Lys22、制备方法及应用,所述对温度耐受性强的裂解酶带有6个组氨酸标签,所述裂解酶的编码序列为SEQ ID NO:1;所述对温度耐受性强的裂解酶Lys22的制备方法包括:人工合成氨基酸编码序列,将双限制性内切酶消化回收后插入原核表达载体pET‑28a(+)质粒;将质粒转化入表达蛋白的工程细菌大肠杆菌BL21中,筛选阳性克隆,并验证序列的正确性;将阳性克隆菌株接种于卡那霉素的LB液体中培养至对数期,加入IPTG,诱导,离心,将上清液过滤、离心,收集滤液,将滤液浓缩,纯化,验证。本发明采用两步分子筛超滤,能起到降低背景中也可能含有多组氨酸的其他蛋白质干扰的作用。