本发明属于基因工程及生化检测技术领域,具体涉及一种突变胱硫醚β裂解酶及其制备方法和应用,突变胱硫醚β裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,由氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示、核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的胱硫醚β裂解酶突变获得,突变位点为V27P,G191P,应用于同型半胱氨酸检测试剂盒中。本发明制备的突变胱硫醚β裂解酶具有酶活高、热稳定性优的优势,将该活性高、稳定性优的突变CBL应用到Hcy检测试剂中,能够很好的通过热稳定性、准确性验证,制得的同型半胱氨酸检测试剂盒具有活性高、投料量少、稳定性好等优点。