本申请公开了聚合酶突变体及其应用。该聚合酶突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过以下突变后的氨基酸序列:第368位的苏氨酸突变为苯丙氨酸、第372位的苏氨酸突变为亮氨酸、第375位的谷氨酸突变为丝氨酸或赖氨酸、第478位的赖氨酸突变为酪氨酸、第484位的丙氨酸突变为谷氨酸、第512位的赖氨酸突变为酪氨酸。该聚合酶突变体至少具有如下有益效果:发明人意外地发现,具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的Phi29聚合酶的上述位点发生突变后获得的突变体对于分子结构更复杂、分子量更大的核苷酸类似物底物具有更高的利用效率,可以有效利用核苷酸类似物进行模板DNA的复制和延伸。