本发明公开了一种婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌属的CRISPR One Pot检测方法,包括:婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌属增菌培养;取增菌液提取DNA;以此DNA为模板加入CRISPR One Pot反应体系,同时进行LAMP扩增和CRISPR反应;动态检测CRISPR反应荧光强度值,根据荧光强度变化曲线判读待检测样品中是否存在克罗诺杆菌属核酸。本发明还公开了一种用于检测婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌属的CRISPR One Pot试剂盒及其应用。采用本发明的CRISPR One Pot检测方法,操作更加便捷,实现了现场恒温检测,同时可以提高克罗诺杆菌属检测特异性、灵敏度,缩短检测时间。