本发明提供了一种用于检测猴痘病毒的环介导等温扩增引物组合及其应用,所述引物组合包括特异性扩增猴痘病毒N4R基因的引物;所述引物组合包括外引物、内引物和环引物;所述外引物包括MPXV‑F3和MPXV‑B3;所述MPXV‑F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述MPXV‑B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明经过广泛而深入的研究和试验,首次揭示一种猴痘病毒的环介导等温扩增检测方法,经过比较筛选找到了针对MPXV特异性良好的引物,所述引物针对含有MPXV以外的核酸不发生特异性扩增,可良好地应用于鉴定MPXV成分,并且具有良好的再现性、灵敏度。