本发明公开了一种能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌及其构建方法和应用。该重组工程菌是通过将突变脂肪酶的重组质粒经酶切线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞，再将线性化的pAO815‑PDI重组质粒二次转化到带有突变脂肪酶基因的毕赤酵母GS115感受态细胞获得；所述的突变脂肪酶为脂肪酶5s或脂肪酶6s；其中，脂肪酶5s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；脂肪酶6s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明中采取于毕赤酵母GS115中共表达分子伴侣PDI的策略，提供产量优化的耐热脂肪酶表达菌株，以缓解引入多对二硫键导致的表达水平较低的问题，特别适合在工业上进行应用。
本发明公开了一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用。该耐热突变脂肪酶是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入多对二硫键突变，获得的富含多对二硫键突变的脂肪酶4s，脂肪酶5s和脂肪酶6s，其中，脂肪酶4s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；脂肪酶5s的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；脂肪酶6s的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明采用迭代组合多对二硫键突变的策略，提高了脂肪酶的热稳定性，与传统引入二硫键的策略相比，通过进一步增加了引入二硫键的数目大幅度提高了中温脂肪酶的热稳定性，特别适合在工业上应用。
本发明公开了一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用。该脂肪酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2N突变脂肪酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的2S突变脂肪酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的3N突变脂肪酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的3S突变脂肪酶。本发明是以S8‑214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8‑214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8‑214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键，实现二硫键突变的组合优化；其中，在不同区域中/间组合二硫键效果更优。获得的突变脂肪酶的热稳定性强，特别适合在工业上应用。
本发明公开了一种高催化活性的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用。该脂肪酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的S118‑177突变脂肪酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的S122‑196突变脂肪酶。本发明通过长时间的高温分子动力学模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程，分析了脂肪酶盖子1区域的解折叠关键亚区，有效地筛选出关键的突变位点。通过实测筛选所得的突变脂肪酶的热稳定性强，且催化活性高，特别适合在工业上进行应用。
本发明公开了一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用。该脂肪酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的S2‑210脂肪酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的S8‑214脂肪酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的S14‑216脂肪酶或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的S191‑241脂肪酶。本发明通过长时间的高温分子动力学模拟模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程，分析了蛋白解折叠的主要区域和湿熔球态形成的关键步骤，有效的筛选出动力学稳定性改造的关键位点。该热稳定的脂肪酶耐热，半衰期长，特别适合在工业上进行应用。
