本发明公开了一种细菌甘油脱水酶突变体Gt9及其表达菌株的构建和应用,其中细菌甘油脱水酶突变体Gt9的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示,编码所述细菌甘油脱水酶突变体Gt9的基因序列如SEQ ID No:2所示。本发明以购买于中国普通微生物保藏管理中心的罗伊氏乳杆菌中甘油脱水酶GtW为野生型出发蛋白,通过定向进化构建突变文库,对酶性质进行改良,以高通量筛选技术获得突变体酶命名为Gt9,其对甘油的耐受能力相比野生型提高了50%,有利于提高抑菌素罗伊氏菌素的产量,增强罗伊氏乳杆菌的抑菌能力和扩宽其抑菌应用领域,也为解决现有酶受底物抑制的影响提供研究基础。