本发明涉及同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩增试剂盒及应用和方法,属于分子遗传学技术领域。本发明所述特异性扩增引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1~50所示的引物,对应的人25个STR基因座包括23个常染色体STR基因座和2个性别鉴定STR基因座。本发明所述特异性扩增引物组对应的基因座包含了目前市面上主流案件需求的所有位点,同时还包含了2个性别鉴定基因座,可有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险;25个基因座联合起来,具有高个体识别力、高非父排除率的特征。