[发明专利]包含蛋白酶编码序列的DNA构建体或者其抑制剂

说明书

本发明涉及在植物和哺乳动物细胞的转化中使用的DNA构建体。特别地，本发明涉及使细胞功能被破坏，并且任选地，使细胞功能的破坏逆转的DNA构建体。本发明还涉及使植物衰老进程减缓或被抑制的DNA构建体。

根据本发明的又一DNA构建体为了提高植物的性能或产率而改变了蛋白质特别是贮存蛋白的代谢的过程。这样的构建体可以用来延迟种子的发芽，因为需要防止收获前抽芽。

因此本发明的DNA构建体使用了能抑制细胞功能需要的蛋白质的DNA序列，或者控制衰老或发芽和/或控制蛋白质特别是贮存蛋白的代谢的DNA序列。象编码前体蛋白那样的DNA序列在本发明中是有用的。

具有前酶原或酶原前体蛋白的蛋白质在本发明中是特别有用的。具有这样的前体蛋白的蛋白质的例子包括蛋白酶。一种这样的蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶(CPs)是植物(Praekelt等，1988；Goetting-Minesky和Mullin,1994)，动物(Wiederanders等，1992)和原生动物(Mallinson等，1994)中大量多基因家庭的成员。半胱氨酸蛋白酶作为失活前体合成(Praekelt等，1988)。所述前酶原导向分泌途径(Marttila等，1995)，并且通过前肽片段的蛋白酶剪切在液泡中转录后加工而产生活性酶(Hara-Nishimura等，1993和1994)。

植物半胱氨酸蛋白酶参与生理学重要的不同的代谢作用。在种子发芽和植物衰老过程中，它们参预蛋白质降解(Jones等，1995；Valpuesta等，1995；Smart等，1995)并且在发芽期间在贮存蛋白的活动化中起着关键作用(Boylan和Sussex,1987)。在种子发育期间，半胱氨酸蛋白酶催化蛋白质前体的翻译后加工以生成其成熟形式(Hara-Nishimura等，1995)。此外，一些或者受赤霉酸(Koehler和Ho,1990；Watanabe等，1991)或者受乙烯(Cervantes等，1994；Jones等，1995)的激素调节。其它在对应激的反应中被诱导，所述应激如受伤(Linthorst等，1993；Lidgett等，1995)，脱水(Guerrero等，1990)，受冷(Schaffer和Fischer,1988)，或者涉及植物-微生物相互作用(Goetting-Minesky和Mullin,1994)。

对于大麦(Marttila等，1995)，稻(Watanabe等，1991)，玉米(Debarros和Larkins,1994)，小豌豆(chick-pea)(Cervantes等，1994)，巢菜(Becker等，1994)表征了发芽特异性半胱氨酸蛋白酶，并且对油菜描述了半胱氨酸蛋白酶(Comai和Harada,1989)。

Taylor等，1995描述了蛋白酶的体外研究。描述了很多蛋白酶，包括半胱氨酸蛋白酶家族成员。大肠杆菌中产生的木瓜蛋白酶和番木瓜蛋白酶Ⅳ的重组前区可以作为四种天然存在的番木瓜半胱氨酸蛋白酶的差别快速结合抑制剂起作用。事实表明蛋白酶前体中的可裂解的“前”区其功能不只是抑制蛋白酶活性而且还有助于折叠。发现大肠杆菌中表达的重组前肽在纳摩尔范围内是它们的同源蛋白酶的选择性抑制剂，而试验的其它半胱氨酸蛋白酶不受存在至多10微摩尔所述前肽的影响(Volkel等，1996)。但是，没有这样的蛋白酶的任何用途的教诲或提示或者本发明的DNA构建体的任何提示。

期望提供一种方法，以控制生物体内可逆细胞破坏，衰老和贮存蛋白代谢这样的功能。

因此，本发明提供一种DNA构建体，包括：

a)第一DNA序列，其包括应答外源诱导物的存在或不存在的诱导型启动子序列，或者在生物体的选定的组织或选定的发育阶段启动基因表达的发育基因启动子；

b)第二DNA序列，其包括编码蛋白酶的序列，与(a)中描述的启动子可操作地连接，且处于其控制之下。

通过外源诱导物的存在或不存在或者在(a)中定义的发育基因启动子的激活导致所述蛋白酶的表达。外源诱导物调控启动子活性的用途是公知的。启动子可以由各种各样的因素刺激，例如环境因素，害虫或病原体的存在或者化学品的存在。特别是，合适的诱导型启动子由外源化学刺激物诱导，因此外源诱导物是化学品。所述外部化学刺激物优选是农业可接受化学品，其应用与农业应用相匹配并且对植物或哺乳动物没有危害。