[发明专利]用蚕生产重组人的血小板生成素制备药物的方法

说明书

本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽类药物技术领域。

1958年Kelemen发现血小板增生症病人血清中存在促进血小板生成的体液调节因子，并称之为血小板生成素(Thromboprotein，TPO)，人的TPO基因全长约6.2kb，被5个内含子所分割，形成6个外显子(Sohma，1995)。转录的起始位点位于编码第一个氨基酸上游1949位核苷酸，终止密码子位于下游3745-3747位核苷酸，人的TPO主要用于因骨髓移植和肿瘤化疗及原因不明所引起的血小板减少症。目前，国内外尚无利用家蚕生产重组人的血小板生成素药物的报道和专利。

以家蚕作为生物反应器，利用家蚕核型多角体病毒表达系统，与从人血浆中合成cDNA进行重组，获得高效表达重组的TPO的重组病毒，表达后的产物经过分子筛纯化后，再经过高压液相分离，获得纯度为90％的TPO蛋白，经过小鼠及猕猴药效研究表明，用蚕生产的重组人的TPO具有明显的生血小板作用，有效率达90％以上。用蚕蛹接种TPO重组病毒后5-7天，收集表达产物经过纱布过滤，18000rpm离心后，再冷冻干燥装成胶囊，经口给药小鼠及猕猴，经过药效学研究表明，口服胶囊具有明确的疗效，有效率达87％，具有开发成新药的前景和广泛的应用价值。具体技术操作方法如下：

1.取人的肝组织100mg，在冰浩中研磨碎后，加入1ml的Trozol(GIBCO BRL公司产品)，充分混匀后在室温下放置10分钟，加入等体积的氯仿，混匀后在4℃条件下，12000rpm离心10分钟，取上清，加入等体积的异丙醇，混合均匀，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，自然干燥后加入经DEPC处理过的灭菌双蒸水20μl。获得肝细胞的mRNA。

2.用GIBCO BRL的反转录试剂盒，取10μl的mRNA进行反转录，合成cDNA具体操作按说明书进行。

3.合成TPO基因编码区上下游的PCR引物，长分别为28bp和29bp，序列如下所示：引物15’AAAGCTTATGGAGCTGACTGGTGAGAAC3’；引物2为GGAATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTC-3’

4.取2μl反转录cDNA作为模板，加16mM 4dNTP 2μl，取引物12μl(1 O.D.引物加ddH₂O 150μl)，引物22μl(1 O.D.引物加ddH₂O 150μl)，加Taq酶5单位(宝灵曼公司产品)，以及其相应缓冲液及MgCl₂(宝灵曼公司产品)，加入至100μl，最后加50μl石蜡油(分析纯)。

5.PCR的反应条件为预变性94℃，10分钟；变性温度94℃，45秒；延伸温度72℃，2秒；复性温度45℃，60秒；循环35次，最后72℃延伸10分钟。PCR产品经电泳鉴定，所扩增的片段长约为1100bp，与预计的完全一致，说明PCR扩增TPO基因成功。

6.将PCR产物，用1％的低融点胶(Sigma公司产品)分离，经电泳后，用手术刀电切下大小为1100bp的片段，回收于1.5ml离心管中，放置于65℃水浩10分钟，加等体积的饱和苯酚(pH8.0)，快速混匀，4℃，12000rpm离心10分钟后，取上清于一新的1.5ml离心管中，再用饱和苯酚提取一次，方法用上。取上清加等体积仿∶异戊醇(24∶1)，混合均匀，室温下放置10分钟，4℃12000rpm离心10分钟，取上清，加2倍体积冷乙醇，混匀，-20℃放置2小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗，自然干燥，加20μl TE溶解后，经电泳检查，片段已被正确回收，置-20℃备用。

7.将回收的片段与经SmaI酶切的pUC19(为GIBCO BRL公司产品)连接，连接条件为，取5μl外源片段，经酶切的pUC191μl，T₄ DNA连接酶1单位，10×缓中液1μl，加水至10μl，20℃连接过夜(所用试剂均为宝灵曼公司产品)。

8.制备JM109(GIBCO BRL公司产品)感受态细胞(制备方见《分子克隆》科学出版社，1989，第一版)，转化连接产物，涂布于含氨卞青霉素、X-gal及IPTG的琼脂培养基上，37℃培养过夜，取白斑进小批量质粒提取(制备方见《分子克隆》科学出版社，1989，第一版)，用HindIII和EcoRI酶切鉴定克隆，筛选到正确的重组子。