[发明专利]抗人MP52的单克隆抗体

说明书

技术领域：

本发明涉及新的鼠抗人MP52单克隆抗体。具体来讲，本发明涉及与二聚体型人MP-52结合，不与单体型人MP-52结合的鼠抗人MP-52单克隆抗体。

另外，本发明还涉及能产生上述鼠抗人MP52单克隆抗体的杂交瘤及其利用。

背景技术：

人MP52作为属于TGF-β超家族的骨生成因子于1994年分离了其cDNA(Biochem.Biophy.Res.Comm.Vol.204,No.2,1994)。人MP52被认为是N末端具有丙氨酸的由120个氨基酸残基组成的蛋白质，其氨基酸序列记载于WO93/16099,WO95/04819中。通过多种动物实验明确MP52和其他的骨生成因子一样与骨生成有关。但是，骨生成时MP52是被什么直接诱导产生，以什么样的机制达到骨生成现在还有很多不清楚的地方，报道也很少。

另外，MP52在小鼠和人中只是N-末端的一个氨基酸不同，其基因在种间高度保守，因此，从小鼠得到抗人MP52抗体不容易。得到鼠单克隆抗体的报道已经记载于WO93/16099。

发明内容：

本发明的目的是提供与二聚体型人MP-52结合，不与单体型人MP-52结合的鼠抗人MP-52单克隆抗体。

试图依靠基因工程学的方法制造人MP52。将整合了编码人MP52cDNA的宿主细胞进行培养而得到人MP52后进行纯化时，使用与人MP-52特异结合的单克隆抗体是一种有效的方法。即，将特异结合于人MP-52的单克隆抗体负载于载体上，并使之与粗纯化的人MP52接触并与人MP52结合，然后再分离人MP52。在这种情况下，分离具有活性的二聚体型人MP-52时，使用特异与二聚体型人MP-52结合的鼠抗人MP-52单克隆抗体有利是显而易见的。

这种抗人MP52单克隆抗体可以应用在人MP52的定量中。人MP52的定量对于MP52诱导因子的确定、骨生成的机制分析是有用的。这种情况下二聚体型MP52在机体内有可能被分解代谢为无活性的单体型或及其片段。通过使用特异地结合于二聚体型MP52的单克隆抗体可以只检测出有活性的二聚体型MP52。

本发明进一步提供，与人MP52生物活性部位结合的抗体。即，提供阻碍人MP 52与其受体结合的抗人MP52鼠单克隆抗体。该抗体特异地识别人MP52的高级结构，并与人MP52活性部位结合而抑制其活性。因为该抗体特异地识别人MP52的活性部位，所以如果存在没有活性的MP52即使是二聚体型MP52该抗体也不识别，这对其分离和定量是很有利的。

本发明中的鼠抗人单克隆抗体根据众所周知的单克隆抗体的制备方法按如下步骤制备。

(1)以人MP52为免疫原长期致敏小鼠，

(2)将致敏小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，

(3)从得到的杂交瘤细胞中筛选产生抗人MP52单克隆抗体的

杂交瘤细胞，

(4)对所需的产生单克隆抗体的杂交瘤进行克隆，

(5)克隆化的细胞通过大量培养产生抗体或将克隆化的细胞

移植到小鼠腹腔中而产生抗体，

(6)分离纯化培养上清中的抗体或腹水中的抗体。

更详细说明上述步骤。

步骤(1)免疫致敏小鼠的制备是，先将人MP52溶解于10mM盐酸溶液中，再与弗氏完全佐剂(CFA)混合并乳化后以四个月四次的频度腹腔注射数次。MP52的含量以10～100μg合适。再过约一个月以后将含有10～100μg人MP52的溶液用弗氏非完全佐剂(IFA)同样乳化后腹腔注射。这样与佐剂一起致敏的小鼠经过1～2个月以后皮下注射不含任何佐剂的人MP5210～100μg，并且在细胞融合数日前再尾静脉注射10～100μg人MP52。