[发明专利]抗人纤维蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因及其应用

说明书

本发明涉及抗人纤维蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因在制备血栓定位诊断试剂和溶血栓药物中的应用。

免疫球蛋白是由多基因重排产生的糖蛋白大分子，其由两条重链和两条轻链结合而成，其中根据其不同种属来源的免疫球蛋白的氨基酸序列的保守性，重链和轻链又可分为恒定区和可变区。重链和轻链可变区构成的抗原结合单位是免疫球蛋白特异性识别和结合抗原的关键，因此，重组可变区基因产生的肽链有小抗体之称。这种由免疫球蛋白重链和轻链可变区组成的单链抗体分子(scFV)只有30KDa左右，能进入机体的各种组织，又能很快地从机体中清除，而且没有FC受体导致的非抗原特异性结合，是病变定位诊断的理想探针。由免疫球蛋白重链和轻链可变区基因重组产生的功能性小抗体scFv能特异性识别和结合抗原。但因缺少恒定区效应分子，scFv本身不会引起全抗体的生物学效应。利用scFv的抗原结合特异性把其它效应分子带到靶位，是人工制备功能性小抗体的目的。用放射性核素标记的scFV定位诊断肿瘤已有报导(Colcher D.et al，J.Natl.Cancer Inst.1990，82：1191-1197)。不同scFV分子还能共价结合构成双功能抗体(Gruber M.et al，J.Immun.1994，152：5368-5374；Jonge JD et al，Mole.Immun.1995，32：1405-1412)，或与其它效应分子如免疫毒素、细胞毒药物、细胞因子或放射性核素等结合构成“魔弹”，已在肿瘤治疗中显示了好的应用前景(Winter G.et al，Nature，1991，349：293-299；Chaudhary VK et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87：1066-1070；Yang J.et al，Mole.Immun.1995，32：873-881；Wels W.et al，CancerRes.1992，52：6310-6317)，促进了各种各样基因工程抗体的研究。针对严重危害人类生命的癌瘤，Chaudhqry等(文献同上)用anti-Tac可变区把免疫毒素带到恶性淋巴细胞，Xiang等(Cancer Biother，1993，8：327-337)用抗肿瘤细胞单抗可变区与Gamma干扰素或肿瘤坏死因子在基因水平拼接，产生融合子，提高了这些细胞因子在肿瘤局部的浓度，减少了它们的毒副作用。这是肿瘤治疗研究中一些成功的例子。除癌瘤外，由纤维蛋白凝块构成的血栓是这类研究的又一个重要目标，研究结果表明抗纤维蛋白scFV可用于深部静脉血栓的定位诊断，也可与溶栓药物如尿激酶结合延长后者的半清除时间和增加导向性能(Holvoet P.et al，Blood，1993，81：696-703)。由此提示采用上述融合分子治疗血栓病时可用较低的剂量，从而减少尿激酶等溶栓药物的严重副作用，是目前溶栓治疗中最具希望的途径。蛋白水平拼接产生的抗纤维蛋白可变区和尿激酶的融合分子在动物实验中显示的良好溶栓性能，促进了基因水平拼接抗纤维蛋白可变区和各种溶栓药物的研究。本发明人以能分泌抗人纤维蛋白单克隆抗体的杂交瘤为出发点，利用聚合酶链反应从杂交瘤的总RNA中扩增出免疫球蛋白重链和轻链可变区基因，经过重组表达出能识别人纤维蛋白的scFV，由此完成了本发明。

因此，本发明的一个目的在于提供一种抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因，两者重组后可表达出特异性识别和结合人纤维蛋白的抗体活性片段。

本发明的另一个目的在于提供由所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因编码的多肽产物。

本发明的再一目的在于提供含重链可变区基因和轻链可变区基因的表达载体。

本发明的又一目的在于所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因在制备溶血栓药物中的应用。

根据本发明，提供了一种抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因，称为VH-8E5，全长为375bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。所述的基因包括IgG2b框架区和三个互补决定区(CDR)，其中CDR1为15bp，位于SEQ ID NO.1的第85-99位核苷酸；CDR2为51bp，位于SEQ ID NO.1的第142-192位核苷酸；CDR3为33bp，位于SEQ ID NO.1的第289-321位核苷酸。此三个CDR区是特异性结合人纤维蛋白的重要结构。