[发明专利]一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法及应用

说明书

本发明属生物技术领域，涉及人碱性成纤维细胞生长因子(Basicfibroblast  growth  factor，简称bFGF)的基因工程制备方法，以及重组人bFGF本身或含有bFGF的制剂作为治疗冠心病及心肌梗塞的药物或保健品。

成纤维细胞生长因子是广泛存在于多种组织中的一类多肽生长因子，1974年由Gospodarwicz从牛脑垂体中发现，由于它对成纤维细胞有明显的促分裂作用，故命名为成纤维细胞生长因子，以酸性和碱性两种形式存在。1985年，人们完成了牛bFGF的氨基酸序列分析工作，在随后的两年中，文献陆续报导了牛和人的各种组织来源的bFGF氨基酸序列，并实现了它的基因克隆和表达。近年来有文献报导bFGF表达水平不断提高(Knoerzer，Gene，75：21-30.1989；Squires，J Biol Chem，263：16297-16302：1988)，由于得到了大量纯品，大大促进了其生物功能研究。目前的研究表明，它除了对成纤维细胞有很强的促分裂作用外，对多种来自中胚层的细胞，尤具是血管内皮细胞有很强的促分裂作用，是所知的最活跃的促血管形成生长因子。是近年来研究最活跃的领域之一。

碱性成纤维细胞生长因子bFGF是具有重要的应用开发前景的细胞因子之一，本发明的目的是通过改造5′端基因，使从中国人外周血中克隆的bFGF基因在大肠杆菌中获高效表达，并利用快速简便的工艺，得到大量的符合标准的临床用药，最终用于冠心病和心肌梗塞的治疗。估计bFGF对下列疾病具有潜在的临床应用价值：

1、通过bFGF的创伤愈合和组织修复作用，可以用于烧伤、烫伤、慢性溃疡、褥疮和严重的软组织挫裂伤的治疗；

2、通过bFGF的神经营养作用，可以用于中枢及外周神经损伤、脑外伤后遗症、脊柱手术后、老年性痴呆、缺血性脑病、神经性耳聋和视神经变性等神经系统疾病的治疗；

3、通过bFGF促血管形成和心肌营养作用，可以用于慢性心肌缺血(冠心病)、急慢性心肌梗塞和冠状动脉搭桥术后再狭窄的治疗。

由于bFGF的以上实用价值，国外已有数家制药公司和厂家在研制生产bFGF的新方法和新工艺。

本发明采用下述技术方案：

(1)鉴于遗传密码有兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱与人体细胞的差异，本发明专门设计合成了人bFGF基因5′端含大肠杆菌偏爱密码子的DNA片段，它可以在不改变产物人bFGF的氨基酸组成与排列顺序的基础上，提高bFGF基因在大肠杆菌中的表达水平。其步骤首先在5′和3′端引物引导下，自中国人外周血单个核细胞总RNA中扩增出特异的人bFGF cDNA片段。将PCR扩增产物插入国内已广泛采用的高效表达载体pBV220中，构建成bFGF表达质粒pBbFGF。它能在大肠杆菌HB101和DH5α中高表达，使bFGF占菌体总蛋白的15％左右，表达率经100次以上传代不降低。

(2)通过发酵工程菌，用M9作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物0D600值可达6左右，生物量为每升培养物6～8g，产物表达率在12.8～16.5％之间。产物表达量可达每升培养物80～100mg。

(3)在此基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和产物抽提、肝素亲和层析纯化、凝胶排阻层析精制。本工艺由于纯化产物来自于可溶性的表达上清，因此产物比活性较高，结构单一。引入肝素亲和层析主要是利用了它的高选择性，进一步的凝胶排阻层析可以去除少量杂质蛋白和热原。每升发酵产物可得人bFGF纯品近40mg，回收率50％左右，纯度＞96％，比活性可达1×10°U/mg水平，明显高出文献报导水平。运用30L发酵罐一批可得到数万人份的bFGF制剂。

(4)纯品加入人血清白蛋白、甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成粉状成品。注射用水溶解后应用，可用于外伤、神经损伤和心肌缺血性疾病的治疗。

治疗实验性兔急性心肌梗塞，给予1.4μg/kg/次人bFGF 6次，疗程10天，可使兔心梗面积和梗塞心肌重量较对照组减少50.9％和53.8％，明显优于阳性对照药物硝酸甘油，明显改善了心功能和血流动力学指标，组织学也显示梗塞区血管增生活跃。结果表明发生心肌梗塞后早期应用bFGF，可以促进急性心肌梗塞的心肌愈合，改善心肌梗塞的预后。人bFGF对心肌缺血/再灌注损伤大鼠的实验结果提示应用后可增加冠脉流量，冠脉流出液中蛋白、酶和其它反映心肌损伤的指标明显降低。