[发明专利]入射光荧光显微镜

说明书

本发明涉及一种入射光萤光显微镜，这种显微镜在医学和生物学领域中用于观测细胞或组织的状态。具体地说，本发明涉及一种入射光萤光显微镜，借助这种显微镜，利用差示干涉观测方法或采用调制差显(modulation contrast)(霍夫曼调制差显)显微镜的光瞳调制显微方法来观测细胞或组织的外形，并且同时利用入射光萤光观测方法检测例如一种物质的位置。

下面将说明第一种常规技术。一般来说，萤光显微镜广泛用于各种领域，例如，用于医学和生物学，以便检测例如在活组织或细胞中的萤光标记的蛋白质或基因。特别是近年来，已可能用差示干涉观测方法来检测细胞或组织的外形，并且同时用入射光萤光观测方法未检则萤光标记的蛋白质或基因，由此检查该蛋白质或基因在所述细胞或组织中的位置。

遗憾的是，要同时进行差示干涉观测和入射光萤光观测，就必须在观测光学系统中安置检偏器(起偏振片)，而且，因为光通过这个检偏器，光的损失会增加。由于萤光图象的光极弱，这尤其是一个问题。因此，为了获得必需的萤光，必须使强烈的激发光辐照在样品上。不过，如果是这种情况，不仅较早地出现萤光光褪色，而且如果样品是活的话，另外还损坏该样品。

要解决这些问题，在“用于生物学的光学显微术”一书的第513到522页中(1989年6月4日到7日在北加利福尼亚的Chapel Hill举行的视频信号显微术国际会议的会议文集，A JOHN WILEY&SONS公司，出版：Brian Herman，Ken Jacobson)，公开了一种显微镜的构造，这种显微镜装置利用分色镜的偏振和透射特性，该分色镜依赖于波长，并且能同时进行差示干涉观测和入射光萤光观测。在这种装置中，分色镜只是在某一特定的波长范围内起到检偏器(起偏振片)的作用。由于对于比所述特定的波长更长的波长透射率高，在这个波长范围中的萤光图象并不变暗。因此，可以高效率地同时进行差示干涉观测和入射光萤光观测。

下面将说明第二种常规技术。近来，已可能通过采用例如调制差显显微镜的光瞳调制显微方法来检测细胞或组织的状态，并且同时通过入射光萤光观测方法来检测萤光标记的蛋白质或基因，由此，检查该蛋白质或基因在所述细胞或组织中的位置，而且还检查该蛋白质或基因的移动。

图12A显示了公开号为51-128548的日本专利申请中所公开的一种装置，通过给通常的显微镜添加一些用于调制差显观测的元件而获得这种装置。如图12A所示，一个调制器102安置在一个物镜103的出射光瞳平面上。如图12B所示，这个调制器102是一个具有三个不同透射率区域的波光片。在这个波光片中，参考标号108表示一个几乎不透光的黑暗部分(D)；109表示一个大约15％透射率的半透明部分(G)；而110表示完全透光的一个光亮部分(B)。

一个光阑106安置在一个聚光镜105的前焦面上。加到光阑106的一侧的P1和安置在P1下面的P2是起偏振片。可通过旋转起偏振片P2来控制穿过光阑106的透射光的量。有调制器102安置在上面的透镜103的出射光瞳平面和有光阑106安置在上面的聚光镜105的前焦面是共轭的。因此，光阑106的像形成在调制器102的表面上。

类似于把相衬显微镜的一个环形光阑调整为相移片的一个环，操作者预先把光阑图像调整到在调制器102上的半透明部分(G)109，而同时利用一个望远镜监控在物镜103的出射光瞳平面上的调制器102。

图13显示了穿过一个透明状态的物体所透射的光通过一个调制器形成一个具有反差的图像的过程。1975年R.Hoffman和L.Gross发表了这个原理。

如图13所示，假定具有某一相位分布的一个透明样品115形成一个棱柱形状。当穿过光阑117并用聚光镜116会聚成平行光线的那些光线进入这个棱柱时，穿过图13左边的倾斜部分的一束光线从入射光线弯向左边，而穿过图13右边的倾斜部分的一束光线从该入射光线弯向右边。穿过上、下表面平行的上述棱柱中央部分的一束光线走直线，不弯曲。