[发明专利]提高红豆杉细胞中紫杉醇含量与释放的方法

说明书

本发明涉及一种提高红豆杉细胞中紫杉醇含量与释放方法。它属于植物细胞培养技术。

紫杉醇具有良好的抗癌作用，尤其是对晚期卵巢癌，转移性乳腺癌和非小细胞肺癌都具有显著的疗效，为此，对于它的开发研究受到人们的重视，如美国BMS公司已投入一亿伍仟万美元的巨资用于紫杉醇的开发与应用的研究。

紫杉醇最早是由短叶红豆杉的茎、皮中分离出来的。红豆杉细胞产生的一种次生代谢产物，即为紫杉醇。该产物在细胞内含量极少，导致工业化生产成本十分昂贵。因此，如何提高红豆杉细胞中紫杉醇的含量则成为人们十分关注的问题，同时也是一个难度较大的问题。目前有效的方法之一是向细胞的培养液中加入诱导子。使用的诱导子有两类：一类是生物诱导子，如高压灭活的真菌、细菌、酵母细胞壁的萃取物等。此类诱导子由于它们自身提取与纯化技术都十分复杂，加之工业生产中难以定量控制，因此应用难度大。另一类为重金属盐诱导子，如钒酸盐、铅、汞等。此类诱导子由于对细胞有较大毒性和伤害作用，又易污染环境，故不宜采用。

本发明的目的，在于提供一种提高红豆杉细胞中紫杉醇的含量与释放的方法。该方法不但可明显提高红豆杉细胞中紫杉醇的含量，而且有利于紫杉醇从细胞中释放。

为了达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。将红豆杉细胞接种于B₅液体培养基中，采用摇瓶发酵，在摇床以120～130rpm和温度于24～26℃及黑暗处条件下培养细胞，细胞的生长期可明显呈现延迟期、对数期、平稳期、衰亡期四个阶段。为提高细胞中紫杉醇的含量与释放，向B₅液体培养基中加入诱导子，其技术特征在于：在细胞生长处于对数期时，向B₅培养液中加入硫酸铈铵稀土化合物诱导子，或者加入硝酸镧稀土化合物诱导子，或者加入硝酸亚铈稀土化合物诱导子。上述所加的稀土化合物的量为0.01～0.4mg/ml_发酵液时效果最佳。

下面对本发明作详尽说明。首先配制B₅液体培养基和稀土化合物溶液。在配制好的培养基中接种红豆杉细胞，培养细胞的生长条件是：采用摇瓶，摇床转速为120～130rpm，温度保持24～26℃，地点为黑暗处。观察细胞的生长过程，当细胞生长处于对数期时，将配制好的并经灭菌处理的稀土化合物溶液按着0.01～0.4mg/ml_发酵液的比例加入培养液中，然后继续培养细胞生长达10～15天，细胞成熟后，对发酵液进行离心分离，对分离得到的上清液和沉淀物再进行萃取等处理得到含紫杉醇的浸膏，采用高压(高效)液相色谱测试紫杉醇的含量，可知细胞内外的含量多少，同时也可通过对比实验，看出本发明的效果。

本发明的效果是十分显著和令人可喜的。以东北红豆杉进行实验，其结果是：红豆杉细胞中紫杉醇的含量，加入稀土化合物诱导子的含量是未加稀土化合物时的含量的2.5～6倍，最高可达7倍，紫杉醇的释放量，加入稀土化合物的释放量是未加稀土化合物时释放量的1.2～5.0倍。本发明的优点还在于所采用的稀土化合物，原料易得价廉，操作运行可靠，过程三废不污染环境。

下面以实施例对本发明作进一步说明。

例一：

1.配制浓度为10mg/ml无菌硫酸铈铵溶液，备用。

2.在250ml的摇瓶称装30mlB₅液体培养基。

3.在培养基中接种20ml浓度为50g(鲜重)/l对数生长期的东北红豆杉细胞种子液。

4.加入1ml无菌硫酸铈铵溶液，并在25℃，摇床120～135rpm，黑暗处培养14天后中止发酵。

5.用4000rpm离心机分离细胞(沉淀物)与上清液。

6.分别萃取细胞和上清液中的紫杉醇。

7.用高效液相色谱采用外标法测定紫杉醇的含量，其结果如表一所示。