[发明专利]一种可以在哺乳动物细胞中高效表达乙肝表面抗原的重组质粒

说明书

本发明涉及一种可用于扩增的谷氨酰胺合成酶基因，和由该基因参与构建的一种高效表达乙肝表面抗原的重组质粒，属于生物技术基因表达或遗传工程领域。

乙型肝炎病毒(HBV)是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常见病因，我国是乙型肝炎的高发区，有50-70％的人群感染过乙肝，8-10％的人群(约一亿人)为带毒者。目前还没有治疗乙肝的特效方法，接种乙肝疫苗是预防肝炎的有效措施。    

血源疫苗已投入生产使用，但不能满足普遍的预防接种的需要。由于血源疫苗存在一些问题，如血源有限、带有肯定的潜在性危险(包括丙肝、艾滋病等)，因此需要急切研究基因工程疫苗。美国Merck公司研制的酵母基因工程乙肝疫苗早在1986年就获得FDA的批准而投入生产。我国利用哺乳动物细胞表达的乙肝基因工程疫苗也获准生产，但用于生产的细胞株的表达水平与酵母系统的表达水平相比，仍相对较低。哺乳动物细胞分泌的HBsAg颗粒具有免疫原性强、抗原提纯简单和适于连续性大规模培养的优点。为此有必要发展新的高表达细胞系，以进一步提高乙肝病毒表面抗原在哺乳动物细胞中表达水平。近年来，乙肝基因工程疫苗特别是乙肝表面抗原蛋白在哺乳动物细胞中表达的研究主要获得以下进展：

自1980年，Dubois(1)等首先报道使用双拷贝HBV初级克隆质粒转化小鼠LTK^-细胞成功表达HBsAg以来，由于哺乳动物细胞具有分泌、糖化、可连续培养的优点，国内外学者应用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达HBsAg方面作了大量的工作。为了提高HBsAg在哺乳动物细胞中的表达水平，早期表达HBsAg时，主要应用HBV自身的启动子，进而使用SV40早期启动子、摄金蛋白(metallothionein)启动子等功能更强的启动子(2-6)。在转化选择标记方面，先后使用过HSV-tk、m-dhfr、Neo、Eco-gpt、mMT(1-3、5-8)等。在扩增基因方面，主要使用了m-dhfr(2-4)和BPV(5，6，9)，都获得了较好的圹增效果。在表达的宿主方面，小鼠LTK^-细胞(1)、小鼠乳头瘤C-127细胞(5，6)、小鼠NIH3T3细胞(9)，绿猴Vero细胞(10-12)，CV-1细胞(8)，COS细胞[13，14]和中华地鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺失型(CHOdhfr^-)[2，15]等传代细胞都获得不同程度表达HBsAg的细胞系。

在国内，1983年阮力等首先报道(16)分别用ayw和adw亚型的乙肝病毒HBV全基因组表达质粒，与HSV-tk基因一起导入LTK^-细胞。

基因重组质粒的特点是：乙肝表面抗原基因由本身启动子的调控，而选择基因HSV-tk基因存在于另一质粒中。两种质粒必须共转化才能选出阳性克隆。

表达系统：采用缺失胸苷激酶基因的营养缺陷小鼠传代细胞(LTK^-)作为其表达系统。

用AUSRIA试剂盒检测细胞培养液中的HBsAg表达量为2.5ug/10⁷细胞/瓶。免疫电镜可见到22nm的HBsAg。

1985年，任贵方等报道(3)，分别用HBV ayw亚型和adr亚型基因组DNA BglII片段构建成四种表达乙肝表面抗原的重组质粒。

此四种重组质粒的特点是：乙肝病毒表面抗原受其本身的启动子的调控，而二氢叶酸还原酶(dhfr)基因受SV40早期启动子的调控。

表达系统：采用缺失胸苷激酶基因的营养缺陷型小鼠传代细胞(LTK^-)作为宿主细胞，用AUSRIA试剂盒检测细胞培养液中的HBsAg分泌量为12.5ug/10⁷细胞/天。

1991年，任贵方等报道(17)，用adr亚型的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)主蛋白基因构建重组质粒(pSV₂DHBR_1-327.2kb)。

此重组质粒的特点是：含有两个SV40启动子，乙肝表面抗原受SV40早期启动子的控制而dhfr基因受另一个SV40启动子的调控，且乙肝表面抗原基因在前，dhfr基因在后。

表达系统：任贵方等采用二氢叶酸还原酶(dhfr)基因缺陷型的中国地鼠卵巢细胞(CHO dhfr^-)作为其表达系统的宿主细胞。

表达产物的检测：

1)电镜下观察，可见22nm大小的HBsAg颗粒。

2)SDS-PAGE电泳显示：可见到23KD，27KD，30KD三条蛋

  白带。