[发明专利]医用胶原蛋白的无变性提取方法

说明书

本发明涉及外科止血、愈伤材料的制备方法，具体地说是指医用胶原蛋白的无变性提取方法及无变性应用。

现有的胶原蛋白的提取多是采用蛋白酶的消化或化学交联的方法制备，这些方法的应用使胶原蛋白的组织相溶性降低，而且有的胶原经变性提取后还引起人体的免疫反应，使胶原蛋白在临床上促使凝血和愈伤的功能受到了限制。

本发明的目的提供一种医用胶原蛋白的无变性提取方法及无变性应用，即从哺乳动物的结缔组织中通过不变性的方法，提取分子结构没有破坏的胶原蛋白，以其作为原料制成冻干的海绵制剂，作为外科止血、愈伤的材料，提高了胶原蛋白的生物学作用、组织相溶性，可避免外伤或手术中过多血液的流失，同时促进伤口愈合。

实现本发明的目的是藉以下方式得以实施的：

选用新鲜哺乳动物的结缔组织，用一定酸度的有机酸溶解，离心分离得沉淀A，于上清液加入NaCL，再离心分离得沉淀即胶原A；将沉淀A再溶于有机酸溶液中，离心上清液中再加入NaCL，离心得沉淀，即胶原B；将胶原A和胶原B按不同比例混匀，在相应的酸溶液和PBS中透析至平衡即可。

所述的酸度为PH2-4；

所述的有机酸包括柠檬酸、乳酸、苹果酸、丙二酸或乙酸等；

所述的NaCL的量为于上清液中浓度为5-20％(重量百分比)；

所述的胶原蛋白A、B的混合比例为10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1。

本发明的方法在实施中，首先将新鲜哺乳动物的结缔组织(如牛皮、猪皮、猪腱、牛腱)用去离子水清洗，打碎后，在有机酸(柠檬酸、乳酸、苹果酸或丙二酸或乙酸等)的溶液中(pH2-4)充分溶解，离心分离得沉淀A；于上清液中加入NaCL，使溶液中NaCL终浓度为5-20％(重量百分比)，静置后，再离心分离得沉淀，即胶原A，将沉淀A再溶于pH2-4的上述有机酸中充分溶解，离心分离得沉淀即胶原B，胶原A和胶原B可按10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1的比例混匀，在PH2-4的有机酸性溶液中和PH7．2的P．BS缓冲液中交替进行透析致平衡。

整个过程要求在无菌条件下进行，温度最好控制在0～4℃。

将0．5～1％胶原蛋白置入平底槽板内，于-50℃下放置4小时后真空干燥机内干燥48小时，最后升温达40℃，冻干成片状的海绵制剂，经切割所需产品大小、包装、密封，γ射线0．5-2．0Mrad无菌消毒后用于外科的止血、愈伤。

在胶原蛋白的提取和止血剂的制备过程中，不加酶和交联剂的作用，也不加入任何使蛋白变性的化学试剂及灭菌而不变性是本发明的特点。

因此，在本发明中，通过以上所述的技术方案达到了本发明的目的之一即提供医用胶原蛋白的无变性提取方法，籍用此方法得到的无变性胶原蛋白具有良好的止血作用，促进肉芽生长和伤口的愈合，且具有良好的组织相溶性，且无过敏反应发生。

另外，通过以上所述的技术方案达到了本发明的目的之二即提供医用胶原蛋白的无变性应用，即对无变性提取方法得到的无变性胶原蛋白进行严格的物理处理，如在特定温度、特定时间内放置，干燥一定时间，升至特定温度，并用特定强度的γ射线消毒处理，由此得到的是一种无变性胶原蛋白制剂，将通过无变性提取方法获得的无变性胶原蛋白制成无变性胶原蛋白制剂，进而实现本发明的目的之二将此医用胶原蛋白的无变性应用，达到提高了胶原蛋白的生物学作用、组织相溶性，可避免外伤或手术中过多血液的流失和促进伤口愈合的作用。

实施例1

选取新鲜的猪皮，去除脂肪、表面筋膜和其它杂质，用去离子水清洗2-3次，用粉碎机碎成小块，在0．02ml／l柠檬酸溶液中充分搅拌48-72小时，以20000转／分的速度离心分离30分钟，得沉淀A，留用；上清液中加入NaCL使其终浓度为20％，静置后再离心离得沉淀此为胶原A，再将沉淀A溶解在0．02ml／l的柠檬酸溶液中，充分搅拌24小时，以20000转／分的速度离心分离30分钟，上清液中加入NaCL使终浓度为20％，静置8小时后离心分离得沉淀-此为胶原B。

将胶原A和B按10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1 1∶1的比例混匀，将冻胶状胶原装入透析袋，分别在0．02％mol／l柠檬酸溶液中和pH7．2的PBS中反复透析至平衡。

整个过程在无菌条件下在0-4℃进行。