[发明专利]蛹虫草的快速高产人工培育方法

说明书

本发明涉及一种微生物的人工培育方法，特别是蛹虫草（Cordyceps  militaris（L）Link）的快速高产人工培育方法。

冬虫夏草（Cordyceps  sinensis  Sace）是虫草属真菌的一种，原产我国四川、西藏、青海、云南等省区海拔3000米雪线以上，因生态环境的限制及过度的采挖，资源日渐枯竭，远不能满足需要，因此国内外许多学者均试图通过接种在蝙蝠幼虫上人工培育冬虫夏草，但困难很大。近年来，许多学者正致力于冬虫夏草菌的工业发酵和在其它虫草中寻找冬虫夏草的替代品。

蛹虫草又名北冬虫夏草或武式虫草，是虫草属的模式种。药效同冬虫夏草，但野生蛹虫草数量不多，因此培育具有天然形态的蛹虫草有很大的潜在市场：CN1034390A专利申请公开了一种蚕蛹虫草的人工培育方法，它是用蛹虫草菌在固体培养基上长出子座，进而以柞蚕为宿主，采用将体表清毒过的蚕蛹投入长有蛹虫草菌的培养基上或用向蛹体注入液体培养菌液这两种方式，使蛹体感染蛹虫草菌，感染后的蛹体置空瓶中培养，获得具有天然形态的蛹虫草。但该培养方法有明显不足之处：（1）蛹体表消毒方法复杂;（2）将经过体表消毒处理的蚕蛹投入长有蛹虫草菌的培养基上，需大量的培养基，并易引起杂菌污染;（3）向蛹体注入液体培养菌液，操作麻烦且易发生败血蛹;（4）感染蛹虫草菌后的蛹体置空瓶中培养，培养出的子座短且易脱落。

本发明旨在寻找一种克服以上方法缺点的蛹虫草快速高产人工培育方法。

本发明的技术方案是：将筛选后的蛹虫草菌接种于含有蛋白质的培养基上，在室内合适的温度和自然光线下，培养至形成大量的分生孢子，挑取分生孢子用无菌水制成孢子悬浊液;将此菌液接种于宿主，并保护至僵硬;将僵硬的蛹，在模拟蛹虫草自然生态条件下培养至子座成熟。

用本发明人工培养的蛹虫草，从接种到子座成熟约35～45天，蛹虫草菌的感染成功率、子座长出率达95%以上，每平方米的栽培面积可收干蛹虫草250～300克，从蚕蛹中长出的子座其外观同野生虫草，子座桔黄、粗壮，长3～8厘米，粗0.2～0.8厘米，偶有分叉，每个蛹体1～3根子座，子座与蛹体干重比可达1∶1.5～2.3。

表1是采用本法培养的蚕蛹虫草与冬虫夏草有效成份含量比较

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

本发明的具体操作方法如下：（1）菌株的筛选：蛹虫草经活蛹体多次复壮后筛选出对蚕蛹致病力强，易形成子座的菌株。（2）孢子悬浊液制作：蛹虫草菌在含有蛋白质的培养基上，在22℃和室内自然光线下培养至形成大量分生孢子，挑取分生孢子用无菌水制成孢子悬浊液。（3）宿主准备：家蚕或蓖麻蚕上蔟后烟熏清毒，一周后剖茧取蛹，剔除病蛹和不良蛹，选适当发育时期的健蛹作宿主，或直接取上簇前的五龄后期幼虫作宿主。（4）蛹虫草菌的感染：用昆虫针或类似物的尖状部分蘸取如（2）法制成的孢子悬浊液，刺人蛹体，每头刺一针。（5）感染后蛹体的保护：感染后的蛹体平摊于蚕匾或类似的框内，适温保护到蛹体僵硬，剔除败血蛹。（6）子座的培育：在模拟蛹虫草的自然生态环境下培养僵硬的蛹至子座成熟，其方法是采用多孔的材料（如煤渣、碎海绵等）在僵硬的蛹体上覆盖一层，在适温和相对温度90%以上，室内自然光线条件下培养。（7）子座的定向生长：为了克服蛹体长出的子座多而细的缺点，使子座长而厚实，可采用子座的定向培养，其方法是：将僵硬的蛹头部朝上，插入有孔（也可人工打孔）易保温的材料上（如蜂窝煤球或预先打好孔的海绵），在上述温湿度，光线条件下培养。（8）蛹虫草的收集保存：蛹虫草成熟后，挖出清洗，用食用酒体表消毒，整理子座，冷冻干燥或60℃下烘干后密封在阴凉干燥处保存。

本法培养的蚕蛹虫草经系统薄层层析表明：蚕蛹虫草所含的脂溶性成份、甾醇、甘露醇、嘌呤、嘧啶、生物碱、游离氨基酸的数量、大小、Rf值与冬虫夏草对应。定量分析结果如表1所示，蚕蛹虫草和冬虫夏草在化学成份上无根本性质差异，但活性成份虫草素、腺嘌呤的含量，蚕蛹虫草是冬虫夏草的3倍。同有关文献报道的冬虫夏草菌发酵物中的含量比较，蚕蛹虫草仍有明显优越性。急性毒性试验表明：蚕蛹虫草按毒性分类法属“基本无毒”级。Ames试验表明：本法培育的蚕蛹虫未见呈现致突变阳性作用。小鼠精子畸变试验表明，本法培养的蚕蛹虫草，对小鼠精子无致畸作用。小鼠骨髓细胞微核试验表明，本法培育的蚕蛹虫草对小白鼠骨髓细胞微核出现率无影响。