[发明专利]同时测定HbALc和类似于HbALc并具有糖基化作用的血红蛋白变异体

说明书

本发明涉及用识别HbAl_c、HbSl_c和HbCl_c的抗体免疫测定血样中糖基化血红蛋白含量的方法以及制备上述抗体的方法。

血红蛋白运输氧和CO₂，它定位于红细胞中，由四条蛋白链组成，其中的两条在各种情况下都具有相同的结构。在任何情况下，血红蛋白都主要由两条非糖基化的α和β链组成。通常，血液中90%以上的血红蛋白是以表示为HbAo的形式存在。

人们已知，具有改变了氨基酸顺序的血红蛋白的α链及β链的变异体会损害血红蛋白分子的运输功能，并异致所谓的血红蛋白病。在血红蛋白病中最为人们熟知的是镰状细胞贫血，它是由疏水性缬氨酸替代了β链第6位上的亲水性谷氨酸。该替代过程的发生导致替代的缬氨酸与β链第1位上的缬氨酸之间产生疏水性环化作用。该结构引起含有这种被改变的β链的HbS分子聚积，进而影响该被改变的血红蛋白的运输功能。另外一种病理性血红蛋白HbC不同于HbA也在于在β链第6位上发生了一个氨基酸取代。此时是赖氨酸取代了谷氨酸。除此之外，还已知具有一个明确氨基酸取代的大量其他血红蛋白变异体（例如HbA₂，HbE）。

由这些血红蛋白变异体与葡萄糖在体内借助非酶学反应形成糖基化的血红蛋白衍生物。该非酶学糖基化作用是一种缓慢、连续的反应过程，它不可逆地进行并且主要依赖于血糖浓度。在糖基化作用过程中，在葡萄糖的醛基与血红蛋白的游离氨基酸之间形成席夫碱。所形成的醛亚胺借助Amadori重排而重排形成N-（1-脱氧-D-果糖-1-基）残基。以该重排形式存在的糖基化血红蛋白是稳定的。

通常形成的糖基化血红蛋白被表示为HbAl_c。前文提到的糖基化血红蛋白变异体表示为HbSl_c或HbCl_c。这些糖基化血红蛋白是由位于血红蛋白β链N末端上的缬氨酸或赖氨酸的游离氨基的糖基化作用形成的。各种血红蛋白变异体在该过程中与正常HbA_o在同样程度上被糖基化（J.Sosenko et al，Diabedtes Care 3，1980，590-593）。

血液中糖基化血红蛋白的浓度依赖于血糖浓度。成人中糖基化的血红蛋白与总血红蛋白的比例正常是在3-6%的范围内。当血糖水平增高时，该比例增至15%。因此，测定N末端糖基化血红蛋白的比例是监测血糖水平的可靠指标。因为红细胞所具有的平均半衰期为120天，所以测定血液中的糖基化血红蛋白提供了一个不依赖于血糖短期增加（如食用富含碳水化合物的饮食后）的血糖水平指标。

因此，测定血液中的糖基化血红蛋白对于诊断和监测糖尿病具有重要意义。因而，已开发了许多用于检测HbAl_c的色谱和电泳方法。然而，利用这些方法不能够同时测定糖基化的血红蛋白与HbAl_c（J.Sosenko et al.Diabetes Care 3，1980，590-593;D.Gold-stein et al.，CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 21，1984，187-225;Allen et al.，Annul.Clinical Biochemistry 29，1992，426-429）。尽管除HbAl_c之外糖基化血红蛋白变异体如HbSl_c或HbCL_c也用亲和层析法同时测定，但该方法对发生于β链N末端的糖基化作用不具特异性，因为所有血红蛋白分子的糖基化作用（例如在赖氨酸残基上或在α链上）都同等被检测（D.Goldstein et al.，CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 21，1984，187-225）。因此，用层析法在患有上文提及的血红蛋白病之一的病人中测定N末端糖基化血红蛋白比例的值太低，而亲和层析法一般检测较高的值。所以，这些现有技术的方法不能用于用患有血红蛋白病患者的血样诊断和监测糖尿病。

现已意外地证明，用含有糖基化的寡肽果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro或其部分作为半抗原成分的免疫原进行免疫获得的抗体可以获得能识别HbAl_c、HbSl_c和HbCL_c并适用于免疫测定HbAl_c、HbSl_c和HbCl_c的方法中的抗体。