[发明专利]白蛋白的纯化方法

说明书

本发明涉及一种白蛋白的纯化方法，更具体地说是涉及从人体血浆组份V中纯化白蛋白的方法。

众所周知，白蛋白是血浆中最大部分的蛋白质，在血浆组份V中含量尤为丰富，白蛋白的浓度约为40克/升血浆。单体形式的白蛋白分子量为66,000至69,000。一般来说，白蛋白可以从人血中分离出来：首先，将血液分离成许多小组份，如血浆、血清。血细胞等，接着再将其分离成许多亚组份，例如组份I、II、III、IV、和V。白蛋白可进一步从组份V沉淀中浓缩并纯化而得到。从血浆中纯化白蛋白的最普通方法是Cohn的冷醇沉淀方法[Cohn等，Journal AmericanChemical Society 68，459-475(1946)]。Cohn方法是通过用乙醇浓度的递增及pH递减的顺序沉淀来分离血浆蛋白，所需的白蛋白大多存在于组份V沉淀中。

当白蛋白用于化学领域或医药领域中时，一般都需要高纯度、稳定且浓度高的产品，必须将混杂于白蛋白中的其它污染蛋白去除掉，所以，纯化白蛋白的步骤，也被称为组分V加工的步骤是必不可少的。在加醇沉淀法中，由于沉淀过程中会使白蛋白变性及沉淀中的白蛋白的机械损失，从组分V中对白蛋白加工的得率低达10-15％。另外，在该组分V加工中也会形成白蛋白的聚合物及二聚物，这不仅减少了纯化白蛋白单体的得率，另外由于白蛋白聚合物引起不需要的免疫应答，故这种产物也会对人体产生副作用。因此，长期以来人们希望能开发出一种从组分V沉淀中纯化白蛋白单体的新方法。

本发明的一个目的在于提供一种纯化白蛋白的新方法，用该方法纯化可得到高纯度的白蛋白单体，其聚合物和二聚物形式的白蛋白收率则极低。

本发明涉及从“纯化白蛋白系统”中提纯白蛋白的方法，所述的“纯化白蛋白系统”包括白蛋白和其它蛋白质浓度5-8重量％，乙醇浓度8-13重量％的水溶液混合物，其特征在于该方法包括下列步骤：

(I)将“纯化白蛋白系统”的pH调至4.5-4.8；

(II)从溶液中滤去沉淀；

(III)将滤液的pH调至4.8-6.5，从溶液中除去乙醇；

(IV)从溶液中除去沉淀物。

下面，我们将对本发明的白蛋白纯化方法作详细的阐述。

在-3～8℃温度下，将适量组分V沉淀溶于8～13％(重量)，较好地溶于9～11％(重量)的乙醇水溶液中以得到蛋白质浓度为5～8％(重量)的混合物，将该溶液的pH进一步调节为4.5～4.8。通过过滤除去沉淀。

将滤液的pH调节至约4.8～6.5，较好调至5.1～5.3后，从溶液中除去乙醇，直至其中的乙醇浓度低于0.05％(重量)为止。所述的从滤液中除去乙醇的步骤可通过超滤渗析、基于分子大小分离溶液组份的压力驱动膜方法来进行，在渗析过程中，盐浓度的减少率与醇浓度的减少率相同，若溶液混浊，再进行过滤以得到纯化的白蛋白溶液。

可用常规的方法使所述的白蛋白溶液稳定。通常向溶液中对于每克蛋白质加入0.08毫摩尔N-乙酰基DL-色氨酸和辛酸钠。将溶液的pH调节至6.8-7.2。使调节好的溶液在60℃下加热消毒10至20小时。

用于本发明中的组分V沉淀可从Cohn方法得到：

在-5℃及搅拌下，通过毛细喷嘴向血浆中加入乙酸盐缓冲液及乙醇-水混合物(0.163％(摩尔)乙醇)，加入速率以50cc至500cc/分钟递增，通过加入乙酸盐缓冲液可使pH控制在4.8，最终得到了沉淀形式的组分V。    

本发明的方法是一个简单而有效的方法，系将组分V加工方法与超滤纯化方法的构思加以合并改进以替代组分V加工的方法。根据本发明的方法，白蛋白的纯度高于97％，这与组分V加工方法所得的纯度相当。值得注意的是，用本发明方法纯化的白蛋白中，单体形式含量较高，白蛋白中其聚合物和二聚体的含量比用常规组分V加工方法纯化所得的白蛋白中的含量要低得多。因此，用本发明纯化的白蛋白可放心地用于治疗中而不会产生任何由白蛋白聚合物所引起的不需要的免疫反应。

下面根据实施例对本发明作进一步详细的阐述，但本发明不为这些实施例所限定。

实施例1