[发明专利]小牛表皮因子的生产方法及应用

说明书

本发明属于生长因子的制备方法技术领域。

表皮生长因子（Epidermal  Growth  Factor，简称EGF）是1960年Cohen最早从小鼠颌下腺中分离，具有刺激新生小鼠提前睁眼和出齿反应。1975年Gregory从人尿中分离到一个与EGF结构相同并具有抑制胃酸分泌功能的活性肽，取名胃抑素（Urogastrone）。近年来日本等国报导医学上EGF具有抗溃疡，促创伤、烧伤愈合，角膜修复及镇痛消炎作用。据商业信息国外EGF已用于化妆品中，国外EGF售价在每0.1mg100美元左右。

本发明的目的是开发EGF在国内的应用并以价格低廉的优势打入国际市场。考虑从小鼠和人尿制备该物质的原料困难，成本高昂，经多次试验已成功地从小牛颌下腺中分离到一种类表皮生长因子，命名为小牛表皮生长因子，简称小牛EGF。

小牛EGF具有EGF的性质，能刺激培养细胞生长繁殖，促DNA合成。整体动物试验具有促进烧伤面愈合和镇痛效应，纯度可达电泳一条带，SDS凝胶电泳测分子量在6000左右，等电点在5.0左右。

本发明的技术方案是取小牛颌下腺加抽提液，匀浆抽提6小时，粗过滤，4000转/分离心30分钟，上清液经CM-纤维素和DEAE-纤维素柱层析，收集活性组分，浓缩后，再经SephadexG75凝胶过滤后，收集活性峰、冰冻干燥即为小牛EGF成品。

本发明制备的小牛EGF的活性测定：

（1）促培养细胞DNA合成：以培养的3T3细胞配制成5×10⁴细胞/ml，加入24孔培养板，每孔1ml，同时加入不同浓度（5，10，20.40ng）的小牛EGF0.1ml，对照组不加EGF而加同体积生理盐水置37℃培养18小时后，加3氢标记胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）2μCi/20μl/孔继续培养6小时，弃培养液，用生理盐水洗了3次后，用5%TCA固定3次，再加入0.1N NaOH200μl/孔。从孔中定量取出100μl/孔置4-9型泸膜上，烘干后置液闪测定瓶，加5ml液闪液于液闪测定仪上测每分钟计数（cpm）计算³H-TdR掺入量与对照组比较，计算小牛EGF活性。每样品同时测定三份。

（2）烫伤愈合试验：小白鼠20～40g20只雌雄各半，分成两组，剪去背部的毛2×2cm，用15mm直径的烫具置80℃水浴预热，每只鼠烫20秒钟，造成Ⅱ度烫伤，烫伤后第二天开始用小牛EGF不同浓度（2，5，10ng/ml）外涂治疗，对照组用生理盐水涂治，10天后小牛EGF治疗组形成痂皮，对照则不能形成，14天后小牛EGF治疗组痂皮脱落伤口愈合，对照组17天后才出现结痂，对比统计证明小牛EGF治疗组的活性。

本发明生产的EGF成本较低，目前售价为1mg/400元人民币，可用于烧、烫伤治疗药及一些皮肤和粘膜（口腔、消化道等）保护药的原料，也可用于化妆品和保健品的添加剂及细胞和组织培养的生化试剂。

下面是本发明的实施例：

取小牛颌下腺500g，加1500mlpH3.9，0.05M醋酸缓冲，匀浆器匀浆，置冰浴中搅拌抽提6小时，静置过夜，4层纱布过滤后，4000rpm离心30分钟，收集上清，上CM52柱（已用pH3.9醋酸缓冲平衡）柱床体积5×15cm，收集穿过的蛋白峰，用NH₄OH，调pH至7.0，接着上DE52柱（已用pH7.0，0.05M醋酸胺缓冲平衡）柱体积3×10cm，先用100mlpH7.0，0.05M醋酸胺洗柱后，以pH7.0，0.05M醋酸缓冲→pH3.9，0.05M醋酸缓冲，0.15MNacl各200ml直线梯度洗脱，分部收集并检测活力，合并活力峰，冻干浓缩后上SephadexG75分部收集检测活力，收集活力峰再冻干。最后得小牛EGF20mg左右。

SDS电泳检查纯度和推测分子量。取小牛EGF产品2mg按Laemmli法进行SDS-PAGE，胶浓度12%。同时做标准蛋白（上海生化所提供标准分子量为94000，64000，34000和12500）电泳6小时，根据标准分子量计算，分子量在6000左右。