[发明专利]抗除草剂玉米选育方法

说明书

本发明涉及能抗氨基酸生物合成抑制剂的玉米细胞株选育方法。

用源于未成熟胚的愈伤培养物可再生玉米植物[Green    C.E.，Philips，R.L.Crop.Sci.15，47（1975）;EP160390;EP177738]。但最初只在少数几种基团型如近交系A188，W64A和Black    mexican    sweet上取得了成功。最初改型的营养培养基可用许多不同的近交系建立起形态生成和胚胎生成的愈伤培养物[Duncan    et    al.，Planta    165，322（1985）]。其中重要的条件是向营养培养基中加氨基酸。

要经过数月或数年才能再生成完整植物的细胞培养物适于突变和变种细胞株的选育。例如，向培养基中加致毒剂量的除草剂时，某些愈伤组织仍存活下来，由此即可再生抗除草剂植物。如用诱变剂处理愈伤组织，则可提高突变产量（US4443971）。

除草剂是酶的抑制剂，而酶又参与氨基酸的生物合成，而在培养基含氨基酸，特别是在其合成受到特定除草剂抑制的氨基酸的情况下，除草剂对细胞培养物的除草作用却很有限。因此，在氨基酸存在下，即到目前为止被认为特别有利于建立和接种可再生的玉米愈伤组织的条件下，难于同时找到可抗阻止氨基酸合成的抑制剂的突变型。

本发明目的就是提出选育这种能够抗阻止氨基酸合成的抑制剂，尤其是抗除草剂的细胞株的方法，其中可在无氨基酸营养培养基中培养植物细胞株。还可在这种营养培养基中用这种细胞株再生植物。这是特别出人意料的，因为氨基酸对愈伤培养物或植物的生长和再生起决定作用。这种培养物可用来选育抗除草剂细胞株，愈伤培养物或植物。

因此，本发明提出的能抗氨基酸生物合成抑制剂的玉米细胞株选育方法，其中在含有除草剂的改性MS或N₆营养培养基中进行培养，该法包括：

a）选育愈伤培养物或细胞悬浮培养物并让其在无氨基酸的营养培养基中生长，同时又保持其胚胎生成和形态生成能力;

b）体外诱变处理所选育的愈伤培养物或细胞悬浮培养物;

c）在无氨基酸的含除草剂营养培养基上培养这些培养物，选育抗除草剂的培养物并由此再生出完整的植物。

以下尤其是以其优选实施方案详述本发明

用下述本发明方法可培养出能再生的抗除草剂植物优选是单子叶植物特别是谷物细胞株。更优选的是采用玉米细胞株。

为选育抗除草剂细胞培养物，必须先建立能在无氨基酸培养基上完好繁殖并可以高频诱发再生植物。为此可在无氨基酸培养基如在改性Murashige Skoog（MS）培养基上进行培养[Physiol.Plant 15，473（1962）]或在改性N₆-培养基上进行培养[Chu C.C.et al，Sci，Sin.16，659（1975）]。这种培养基主要含碳源如蔗糖，葡萄糖，麦芽糖和棉子糖，氮源如铵盐或硝酸盐以及专业人员熟知的维生素，激素和无机盐。

优选的是向有关营养培养基中添加一种或多种可有效影响培养物生长的生理有机酸或其盐特别是柠檬酸循环酸如柠檬酸，苹果酸，草乙酸，琥珀酸和丙酮酸或其盐且优选为钠盐和钾盐特别是铵盐。这些添加剂有助于愈伤或细胞悬浮培养物在无氨基酸培养基上生长并且能够在标准培养条件下经过长时间即至少1-2年的接种而不丧失植物再生能力。因此，这些化合物可代替氨基酸加入营养培养基，其浓度优选为约0.1-10mmol特别是0.5-2mmol。标准培养条件理解为专业人员熟知的条件。如可在15-35℃优选为20-30℃下进行培养，其中可有光照或无光照。转移期限一般可选为10-30天优选为14-21天，当然这取决于培养物的生长情况。

然后再用能在无氨基酸培养基上进行生长的细胞株选育抗抑制剂特别是抗除草剂的愈伤培养物和细胞悬浮培养物。采用这些培养物可进行抗基本上所有抑制剂但优选的是抗阻止氨基酸合成的除草剂的选育。其中优选的是进行抗下式除草剂的选育

式中各取代基互不关联，

R¹为羟基或甲基，

R²为羟基，甲基或乙基，

R³为亚氨基甲基，亚羟基甲基或羰基，

R⁴为OH或其中x为1-5优选为1-2，

n为0-4，优选为0-2。

特别优选的是Glufosinate（Phosphinothricin）或其结构类似物如Bialaphos以及二甲基氧膦基羟基乙酸。若为旋光的，则可用这些化合物的外消旋物或生物活性对映体。