[其他]昆虫抗性植物

说明书

本发明涉及遗传工程、生物化学及植物转化领域。更具体地说，本发明旨在转化植物细胞以表达一种编码对鞘翅目昆虫有毒的蛋白质的嵌合基因。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，B.t.）是一种形成芽孢的土壤细菌，已知它能产生一种对许多种昆虫有毒的伴孢晶体蛋白。其中大多数菌株有抗鳞翅目昆虫（蛾和蝴蝶）的活性，有几个菌株据报道具有抗双翅目昆虫（蚊和蝇，参见Aronson et al.1986）的活性。这些菌株中有许多菌株的毒素基因已被克隆，并且这些毒素已在异源宿主中得到表达（Schnepf et al.，1981;Klier et al.，1982）。近年来，苏云金芽孢杆菌黄粉变种（B.t.var.tenebrionis;B.t.t.，Krieg et al.，1983;Krieg et al.，1984）及苏云金芽孢杆菌圣地亚哥变种（B.t.var.san diego;B.t.sd.，Herrnstadt et al.，1986）菌株已鉴定为具有抗鞘翅目昆虫的活性。已克隆了B.t.sd.的毒素基因，但在大肠杆菌（E.coli）中产生的毒素据报道比来自B.t.sd.晶体的毒素体积大，这意味着此重组B.t.sd.毒素的活性较弱。

对鞘翅目型苏云金芽孢杆菌蛋白毒素作用敏感的昆虫包括（但不限于）马铃薯叶甲（Leptinotarsa    decemlineata）、棉铃象（Anthonomus    grandis）、黄粉虫（Tenebrio    molitor），榆黄叶甲（Pyrrhalta    luteola）及黄瓜十一星叶甲食根亚种（Diabrotica    undecimpunctata    howardi）。

因此，如果能够转化植物使其以具有杀虫效力的水平表达鞘翅目型毒素，那么就有可能用遗传工程方法改造植物使其表现对鞘翅目昆虫的毒性或耐性。受鞘翅目昆虫影响的重要农作物包括苜蓿、棉花、玉米、马铃薯、油菜（canola）、水稻、烟草、番茄、甜菜及向日葵。

尽管某些嵌合基因已在转化的植物细胞和植株中得到表达，但这种表达决非直截了当。具体地说，鳞翅目型B·t·毒素蛋白的表达特别成问题。现已发现，本领域内关于鳞翅目型B·t·毒素蛋白在植物中表达的技术不能扩展到鞘翅目型B·t·毒素蛋白。这些发现与先有技术截然相反。先有技术认为可用同样的基因操作在转化植物中获得这类毒素的有效表达。

根据本发明的一个方面，提供了一种使植物表现出对鞘翅目昆虫有毒性的遗传转化方法，它包括以下步骤：

（a）在易受鞘翅目昆虫侵袭的植物细胞的基因组中插入一个嵌合基因，该嵌合基因包括：

ⅰ）一个启动子，它在植物细胞中起着引起RNA产生的作用;

ⅱ）一个DNA顺序，它引起编码鞘翅目型苏云金芽孢杆菌毒素蛋白的RNA顺序的产生;

ⅲ）一个3′非翻译DNA顺序，它在植物细胞中起着使多聚腺苷酸加到RNA顺序3′端的作用;

（b）获得转化的植物细胞;

（c）从已转化的植物细胞再生出对鞘翅目昆虫有抗性的遗传转化植物;

根据本发明的另一方面，提供了一种嵌合植物基因，该嵌合基因包括下列顺序：

（a）一个启动子，它在植物细胞中起着引起RNA产生的作用;

（b）一个DNA顺序，它引起编码鞘翅目型苏云金芽孢杆菌毒素蛋白的RNA顺序的产生;

（c）一个3′非翻译区，它在植物细胞中起着使多聚腺苷酸加到RNA顺序3′端的作用。

根据本发明的另一方面，还提供了细菌细胞、转化的植物细胞和植物转化载体，分别含有由上述成分（a）、（b）及（c）构成的DNA。

根据本发明的另一方面，还提供了一种含上述转化的植物细胞的分化植物，该植物表现对鞘翅目昆虫的毒性。本发明还期望获得能产生上述转化植株的种子。

图1表示用于分离B·t·t·毒素基因的DNA探针。

图2表示制备质粒pMON5432所用的步骤。

图3表示在pMON5420和pMON5421中编码毒素基因的3.0Kb    HindⅢ片段相对于pUC119多联接子的定向。

图4表示测定pMON5420和pMON5421中所含的B·t·t·毒素基因顺序所用的方法。

图5表示编码644个氨基酸的毒素蛋白的B·t·t·基因的1932bp    ORF的DNA顺序以及限制位点的位置。

图6表示用SDS-PAGE分析观察到的B·t·t·毒素的条带。