[其他]D-α氨基酸类物质的制造方法

说明书

本发明是采用微生物菌种2262菌，把DL-5海因类物质直接转化为相应的D-α氨基酸类物质的生产方法。在D-α氨基酸类物质中包含有D（-）苯甘氨酸和D（-）对羟基苯甘氨酸，这样一些在半合成抗菌素医药工业中极有用的物质。

目前这类物质的合成方法，通常采用化学拆分方法。以D（-）苯甘氨酸为例，常用的拆分方法有：让具有光学活性的樟脑磺酸作用于DL苯甘氨酸，生成两种非对映体构造的盐，利用其溶解度差使其相互分离，然后回收具有光学活性的苯甘氨酸;让具有光学活性的N-甲基麻黄碱同DL苯甘氨酸作用形成盐，利用其溶解度差进行分离的方法。还有让DL苯甘氨酸酯化后让同L（+）酒石酸形成盐的方法等。除上述外还有多种方法，但均由于分割剂价格较高一次性操作光学活性体的收率低，需建立复杂的消旋工程，存在着成本和环境污染问题。

近年来，随着半合成抗菌素事业的发展，酶法拆分工艺开始引起人们的重视。中科院北京微生物所孙万儒和上海医工院愈长銮等在《微生物学报》和《氨基酸杂志》相继发表文章，报导他们的研究成果。其工艺的主要特征是利用二氢嘧啶酶的特异性，对DL苯海因进行不对称拆分，生成N-氨甲酰基-D苯甘氨酸，然后在酸性条件下，经化学水解生成D（-）苯甘氨酸。

本发明利用从土壤中筛选而得的微生物2262菌，通过微生物的作用，将DL-5海因类物质直接转化为D-α氨基酸类物质，即：

（R代表、烷基、苯基或其它置换基）

这种制造方法工艺简单、成本低、产品比旋度高，并可减轻对环境的污染。

2262菌的培养条件：

作为碳源可供利用的，主要是单糖和双糖，如葡萄糖、山梨醇、蔗糖、乳糖和丙三醇。淀粉、醇类和有机酸利用情况不佳。作为氮源尽管有机氮源和无机氮源都可利用，但以有机氮源为佳，效果最好的是玉米浆和酵母膏。其它无机离子Mg⁺⁺、Na⁺、CO⁺⁺对产酶有明显的促进作用。

2262菌所产的酶是诱导酶，因此在发酵过程中，必须加适量的诱导剂DL-5甲硫乙基海因。

2262菌是好气性菌，在PH5-9温度20-40℃的通气条件下，生长良好。

在发酵时使用液体培养，一般发酵周期在20-30小时，发酵结束后，离心收集菌体。由于酶是胞内酶，所以拆分反应时，直接使用收集到的菌体。

拆分反应条件。拆分反应是在酶的作用下对DL-5海因类物质的不对称水解，一方面在酶的作用下，只有D型的5取代基海因能发生水解反应，反应后只产生D-α氨基酸类物质。另一方面在D型的5取代基海因被水解后，L型的5取代基海因在反应条件下（碱性水溶液）能自动消旋。这样，边拆分水解，边消旋，直至反应底物被完全水解为止。

由于参加反应的是正体细胞，而不是经过精制处理的酶，因此，要设法控制副反应的发生。其控制方法是在反应过程中用氮气隔绝氧气，防止氧化作用。

反应中DL-5苯海因和DL-5对羟基苯海因的投入浓度可在2-8%，PH7-10;反应温度25-35℃;反应周期20-75小时。

反心结束后，离心去除菌体和杂质，然后在减压条件下55-60℃浓缩，用1NHCl酒精溶解、过滤，将清液调PH7.0，即得D（-）对羟基苯甘氨酸或D（-）苯甘氨酸。

实例一：

取葡萄糖20.0克、玉米浆10.0克、NaCl3.0克、MgSO₄7H₂O0.5克、（NH₄）₂SO₄1.0克、CoCl₂0.1克、DL-5甲硫乙基海因20ml（化学反应原 液）、加自来水1000ml、调PH7.0-7.2然后再加Na₂HPO₄12H₂O4.0克、KH₂PO₄1.0克，溶解后分装入250ml三角瓶中，每瓶装50ml，而后加8层纱布，用牛皮纸包好后，1.0kg高压蒸汽灭菌30分钟备用。

将冰箱内保存的菌种，取出后，接在新鲜斜面上，培养24小时，接入上述制好的液体培养基中，30℃180转/分摇床振荡培养30小时后，4000转/分离心机离心30分钟，收集菌体，制成菌悬液（每100ml菌悬液含湿菌体40克左右）。