[其他]有机化合物的改进

说明书

本发明涉及木质素改性和降解酶。木质素是由取代肉桂醇前体经自由基的聚合作用生成的复合聚合物，含有15～35%（重量）干木材。浆化处理时，必须从包有木质素基质中将纤维素离解出来，使他们能互相结合，得到具有强度的最终产物。这种聚合物的分离，可以采用化学浆化方法去除木质素，或采用高得率的机械浆化方法保持木质素。漂白处理时，去除木质素，得到发亮的浆料。

木质素对生物腐蚀具有很高的抗性，业已证明，任何有机体都不能以木质素作为唯一碳源进行生长。但是，这种复杂的木质素聚合物通过各种高级真菌的纯培养物可以完全降解。对白蚀菌（white-rot    fungi）的木质素生物降解作用进行的最广泛的生理研究证明，使用Corticra-ceae族系的Phanerochaete    Chrysosporium    Burds能够对木质素进行充分的降解。

在一定的实验室条件下，大约培养3天的时间，还观察不到真菌对木质素的降解作用。接着，培养菌对碳或氮产生饥饿现象，培养4或5天至多6天，开始观察到木质素的降解。根据对碳氮的饥饿诱导木质素降解，说明真菌的木质素代谢属于一种次级代谢性质。

目前真菌的木质素降解由于若干原因还不能实现工业化。由于诱导降解木质素的效率仅仅是作为次级代谢的结果，所以木质素降解的速度慢得令人难以接受。为此，要求继饥饿之后即开始生长时期。此外，真菌把纤维素作为其主要营养来源，导致浆料产量降低和浆料制品质量低劣。

世界专利文件WO 87/00550号介绍了名为rLDM^TM6的木质素降解酶制剂，它是由P.Chrysosprium衍生得到的（rLDM^TM6是由麻省坎布里奇Repligen公司制造的木质素降解和改性酶的商品牌号）。这种酶制剂基本上是纯化的，因此基本上也不含其他rLDM^TM，它是一种天然的降解蛋白酶。这种酶含有与血红素单位相结合的蛋白质成分（脱辅基蛋白），该血红素单位等同于以氧化形式（Fe⁺₃）存在的正铁血红素Ⅸ。这种rLDM^TM6制剂具有适用于木材制浆和污水处理的理想性质。rLDM^TM显示有过氧化物酶的活性，其重要性质的特征在于，在有过氧化氢存在的条件下，能将藜芦基醇催化氧化为藜芦基醛。关于rLDM^TM的物理参数公诸如下：

（1）用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶泳（SDS-PAGE）测定的分子量;

（2）氨基酸组分;

（3）血红素含量;

（4）与抗体反应速度的等同性;

（5）对木质素模拟底物作用的特异性;

（6）按规定的乙酸钠体积摩尔浓度洗脱FPLC层析柱。

尽管可按WO87/00550号专利文件所述方法制备rLDM^TM6，但是如果能够克隆编码rLDM^TM6蛋白的DNA异在适宜的宿主中表达，则用遗传工程方法可期望更有效地实现是rLDM^TM6的制备。然而由于P.Chrysosporium基因的活性在异种宿主中的表达，以前从未取得成功，并且现有技术也从未提供过如何成功地进行这种克降和表达，所以对此能否获得成功还很难预料。

本发明通过克隆编码木质素酶蛋白的DNA顺序及其在适宜宿主细胞中的表达和用正铁血红素Ⅸ重建重组木质素酶蛋白，提供重组rLDM^TM6木质素酶。

于是，本发明提供源于天然P.Chrysosporium的编码rLDM^TM6蛋白的DNA顺序，其顺序示于表1。从DNA顺序中推导得到的蛋白质的氨基酸顺序示于同一表中。

为rLDM^TM6蛋白编码的DNA顺序的克隆开始于从Phanerochaete chrysosporium的发酵中制备足够量的RNA。大量RNA是从名为SC26，NRRL 15978的ATCC24725的紫外线诱导突变体制备的。

在用逆转录酶复制mDNA后，基因库包括为次级代谢中的基因编码的DNA顺序，该次级代谢包括木质素改酶或木质素降解酶的构建。对rLDM^TM6的抗体反应用来检验基因库。对交叉反应克隆进行检测。用常规方法，从克隆的分离物中制备噬菌体DNA。然后将该DNA插入到以后将rLDM^TM6蛋白表达于反应潜能宿主的适宜载体中。