[发明专利]一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法

说明书

本发明公开了一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，本方法：(1)利用光照培养箱进行甘蔗种茎催芽培养，10‑15天即可获得大量试验材料，与利用愈伤组织或常规桶栽相比，大大缩短了材料培养时间，解决材料培养周期长的问题；(2)利用Cellulase‑RS搭配MacerozymeR‑10进行酶解，对甘蔗酶解效率高，酶解4h即可获得大量原生质体，大大缩短了试验操作时间；(3)本方法在酶解前利用0.6mol/L甘露醇进行预质壁分离处理10min，代替常规方法中酶解时用真空泵抽真空30min的处理，缩短了试验操作时间，且简化了仪器设备；(4)本方法全程利用常规角转子离心机即可操作，无需水平离心机。(5)本方法获得的原生质体产率高、每克鲜重组织可获得约1.5×10⁷个原生质体、原生质体活力较高，约为85.7％。

技术领域

本发明属于植物原生质体技术领域，具体涉及一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法。

背景技术

原生质体是细胞壁以内各种结构的总称,也是组成细胞的一个形态结构单位，活细胞中各种代谢活动均在此进行。原生质体包括细胞膜(cell membrane)、细胞质(cytoplasm)、细胞核(nucleus)和细胞器(organelle)等。植物原生质体具有以下的特点：①无细胞壁的物理障碍；②能获得遗传性状和生理性状较一致的细胞群体；③植物原生质体同样具有全能性；④用组织培养方法可进行大量繁殖。这些有利的特征决定了原生质体是一个极好的实验体系，在植物细胞生物学上有广泛用途。可用于体细胞杂交、遗传转化、功能基因的亚细胞定位、单细胞测序等研究的理想材料。

目前甘蔗原生质体分离制备研究中，对甘蔗原生质体的获得，大多利用愈伤组织、悬浮细胞、尾梢、桶栽种植等材料获得甘蔗原生质体，且需要真空泵、水平离心机等设备。现有技术中，关于甘蔗原生质体制备方法存在下列缺陷：1、试验材料培养周期长、易造成材料浪费；2、需要抽真空、长时间酶解、反复漂洗纯化原生质体细胞等操作，操作繁琐、费时；3、对仪器设备有一定要求，如需要真空泵、水平离心机、对普通实验室不适用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，该方法利用光照培养箱在磁盘内进行甘蔗种茎催芽培养，缩短了试验材料培养周期，解决材料培养周期长的问题；该方法利用‘Onozuka’品牌的Cellulase-RS搭配MacerozymeR-10进行酶解，对甘蔗酶解效果好，酶解效率更高，酶解4h即可获得大量原生质体细胞，缩短了试验中的酶解时间；在酶解前利用0.6mol/L的甘露醇进行预质壁分离处理10min，代替常规方法中酶解时用真空泵抽真空30min的处理，一是缩短了试验操作时间，二是简化仪器设备；全程利用常规角转子离心机即可操作，无需水平离心机等设备。

为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，包括以下步骤：

S1：材料培养与初处理：

利用甘蔗种茎催芽培养获得幼嫩蔗苗，取样时从蔗苗基部切下整株幼苗，剥去外层较老的叶鞘和上部较老叶片后插入装有少量无菌水的烧杯中保鲜，得到初处理材料备用；

S2：材料预质壁分离

取无菌三角瓶，用锡箔纸或报纸包裹避光，加入甘露醇溶液后称重；进一步剥去S1获得的初处理材料的外层较老的组织，将所述材料里面幼嫩的茎叶组织用手速胡刀片快速切成细丝，切好的细丝立即放入甘露醇溶液中，再次称重；然后暗处理，得到预质壁分离材料；

S3：酶解与酶解清洗