[发明专利]一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物及其制备方法和应用

说明书

本发明属于肾损伤修复技术领域，涉及一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物及其制备方法和应用。本发明提供了一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物的制备方法，包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞来源的细胞膜进行反复梯度挤压，得到人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物。本发明所述人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物能够抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡，以及转化生长因子‑β引起的纤维化样改变。体内用于急慢性肾损伤小鼠模型治疗后发现更能够缓解肾脏损伤，这为hucMSC‑EVM治疗急慢性肾损伤提供了新的策略。

技术领域

本发明属于肾损伤修复技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derivedextracellularvesicle mimetics，hucMSC-EVM)及其制备方法和应用。

背景技术

根据病因，肾脏疾病可分为原发性、继发性和先天性疾病。急性肾损伤(AKI)临床表现多样，并伴有突发性肾功能障碍。近20％的AKI住院患者显示资源利用率增加和预后不良。AKI和慢性肾脏疾病(CKD)是相互关联的。AKI的持续病理变化导致CKD的发展，CKD打破了肾小管周毛细血管、肾小管细胞和间质细胞之间的微环境平衡，其最明显的特征之一是细胞外基质的沉积和纤维化的形成。尽管存在透析、保守治疗和肾移植等治疗方式，肾脏疾病仍然对人们的健康构成重大威胁。肾脏疾病的治疗具有很大困难，迄今为止，大多数肾脏疾病都无法治愈。因此，探索更有效的治疗方法仍然是治疗肾脏疾病的重大挑战。

间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和多向分化能力。MSCs可以从多种来源获得，包括骨髓，脂肪组织，羊膜，绒毛膜和脐带。其中，人脐带间充质干细胞(hucMSCs)具有较强的增殖能力、较低的免疫原性、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等优势。研究发现，hucMSCs在糖尿病肾病、骨关节炎、肝硬化、心脏病等具有一定的疗效。然而，MSCs的长期安全性、储存和运输困难等问题限制了其临床应用。因此，迫切需要寻找干细胞衍生物进行替代治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物及其制备方法和应用。本发明通过梯度挤压方式制备所得的hucMSC-EVM能够缓解肾组织凋亡，促进增殖；以及减少胶原纤维的生成，本发明为hucMSC-EVM治疗急慢性肾损伤提供了新的策略。

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物的制备方法，包括以下步骤：

将人脐带间充质干细胞来源的细胞膜进行反复梯度挤压，得到人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物。

优选的是，所述梯度挤压包括：将人脐带间充质干细胞来源的细胞膜依次通过1μm、400nm、200nm、100nm孔径的脂质体挤出膜。

优选的是，所述脂质体挤出膜包括聚碳酸酯膜。

优选的是，所述反复梯度挤压的次数≥20次。

优选的是，所述人脐带间充质干细胞来源的细胞膜的提取方法包括以下步骤：

将人脐带间充质干细胞进行原代培养、传代培养，得到传代至P3～P6代的人脐带间充质干细胞，消化，第一离心，得到细胞沉淀；

将所述细胞沉淀与蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合，裂解，第二离心，得到人脐带间充质干细胞来源的细胞膜。

优选的是，所述裂解的条件包括冻融2～3次后，超声处理2min，所述超声处理为每超声10s冰上放置10s。

优选的是，所述第二离心包括：在4℃，800g离心10min，得到第一上清；将所述第一上清在4℃，10000g离心30min，得到第二上清；将所述第二上清在4℃，100000g离心2h。