[发明专利]催化效率提高的双功能纤维素酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种催化效率提高的双功能纤维素酶突变体及其应用。本发明以GH5‑5家族Bispora sp.MEY‑1来源的具有纤维素酶与甘露聚糖酶活性的双功能纤维素酶BsCel5B作为母本，发现位点Ala261对酶的催化特性有着重要的影响。突变为Ala261Gly后，可获得纤维素酶活性和甘露聚糖酶活性同时提高的突变体。在此改造条件下，纤维素酶突变体对纤维素底物的催化效率比突变前提高了56%，甘露聚糖催化效率提高了21%。突变体更为优越的双功能的特性比野生型有着相对广阔的应用空间，也为其他纤维素酶的改造提供了新的思路。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种催化效率提高的双功能纤维素酶突变体及其应用。

背景技术

当今世界人口数量增长迅速，石油、煤炭等不可再生资源不仅在储存量上难以满足人们日益增加的需求，也引发气候变暖等环境问题。木质纤维素作为自然界中含量丰富的可再生资源，逐渐成为化石燃料的理想替代品。

糖苷水解酶作为重要的工业用酶，可以有效的将木质纤维素水解成可发酵糖，再转化为生物燃料或商品化学品。尽管随着现代研究的发展，木质纤维素降解能力大大提高，但是酶制剂仍然是纤维素转化过程中最主要的工业成本。植物生物质中，纤维素和半纤维素甘露聚糖含量占70%以上，因此具有同时降解纤维素和甘露聚糖能力的纤维素酶若取代单功能酶，将有效提高糖产量降低成本，对木质纤维素的降解的工业化应用意义重大。迄今为止，研究人员通过各种策略获得多功能酶，除了大量筛选天然酶外，利用蛋白质工程手段对酶分子进行改良也是研究热点。

催化活性是衡量酶工业化应用价值的重要指标，多功能酶催化活性的改造相对于单功能酶存在着更大的挑战。许多单结构域的多功能酶都共享着催化通道内的催化残基与大部分底物结合位点，由于这些位点在功能上存在着平衡与制约，因此如何同时提高多种活性是研究者不断追求的目标。目前，蛋白质工程领域常用的方法主要为理性设计、半理性设计与定向进化。与定向进化和半理性设计相比，理性设计可以更为准确的达到靶向改造多功能酶的目标，成为扩宽多功能酶工业应用潜力的有效改造手段。

酶反应过程中构象变化主要是loop区的变化引起的，loop的运动可以保护酶的疏水核心，还可以使得活性位点靠近底物加速催化。因此，利用理性设计对酶的loop区进行改造，不仅可以探究loop区对酶催化功能的影响机制，还可以指导酶的分子改良，是多功能酶改造的有效途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种催化效率提高的双功能纤维素酶突变体及其应用。

一种催化效率提高的双功能纤维素酶突变体，所述纤维素酶突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

所述催化效率提高的双功能纤维素酶突变体基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：4所示。

所述双功能纤维素酶突变体基因的载体。

所述双功能纤维素酶突变体基因载体的工程菌。

扩增所述双功能纤维素酶突变体基因的引物。

一种通过优化loop提高双功能纤维素酶催化效率的方法，按照如下步骤进行：

1) 将纤维素酶 BsCel5B的野生型序列片段克隆到表达载体pPIC-9r上，重组载体命名 pPIC9r-BsCel5B；

2) 以重组载体 pPIC9r-BsCel5B为模板，通过携带突变位点的引物对其进行扩增，获得携带突变体序列的重组载体，命名为 pPIC9r-BsCel5B-A261G。