[发明专利]一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法

说明书

本发明属于微生物遗传转化技术领域，具体涉及一种假拟盘多毛孢属(Pseudopestalotiopsiscamelliae‑sinensis)真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。本发明以酶解液对假拟盘多毛孢属真菌幼嫩菌丝进行裂解制备假拟盘多毛孢属真菌原生质体，获得的原生质体数量适宜，质量好，且步骤简便易操作。以此方法获得的假拟盘多毛孢属真菌原生质体可以快速有效地进行PEG介导的假拟盘多毛孢属真菌遗传转化，且转化效率较高。

技术领域

本发明属于微生物遗传转化技术领域，具体涉及一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。

背景技术

假拟盘多毛孢属真菌是最常见的植物内生菌之一，Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis P-1-1菌株为茶树内生真菌，mCherry标记能在具有生命特征的寄主里表达形成生物发光蛋白，不伤害活细胞，不改变菌株致病性，荧光信号在荧光显微镜下检测到的光源单一且稳定。诸多研究者将不同真菌进行荧光蛋白基因标记以探究其侵染机制。

而对于假拟盘多毛孢属真菌侵染规律、互作机制及关键功能基因的研究鲜见报道，只有建立稳定高效的PEG介导的假拟盘多毛孢属真菌原生质体遗传转化体系，提升该菌遗传转化效率，可为后续研究该菌的功能基因以及与寄主的互作机制提供参考方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法，所裂解的原生质体数量适宜，质量好，步骤简便，可以提高后续遗传转化的转化效率。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

将假拟盘多毛孢属真菌菌丝与酶解液混合，得到裂解液；

将所述裂解液培养4～7h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括假拟盘多毛孢属真菌原生质体；

优选的，所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体在所述原生质体液中的浓度为(4.9～5.9)×10⁶个/mL。

优选的，所述裂解的震荡频率为80～120rpm，温度为28～32℃，时间为10～30min。

优选的，所述假拟盘多毛孢属真菌包括Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis P-1-1菌株。

优选的，所述假拟盘多毛孢属真菌菌丝的制备方法包括：

将活化的假拟盘多毛孢属真菌菌株接种至PDB培养基中进行培养，得到菌丝球；所述PDB培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为28～32h。

将所述菌丝球进行研磨后接种至M3S培养基中进行菌丝培养，得到假拟盘多毛孢属真菌幼嫩菌丝；所述M3S培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～15h。

本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法在构建假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系中的应用。

本发明还提供了一种假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系的构建方法，包括如下步骤：

采用上述技术方案所述的制备方法制备得到假拟盘多毛孢属真菌原生质体；

将所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体与STC溶液混合，得到假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液；

将所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒、肝素钠溶液混合，0～4℃静置30min，得到第一原生质体溶液；

向所述第一原生质体溶液中逐滴加入SPTC溶液，0～4℃静置30min，得到第二原生质体溶液；

将所述第二原生质体溶液悬浮于再生培养基复苏，得到复苏的原生质体溶液；