[发明专利]一种诺如病毒VP1融合蛋白及表达方法

说明书

本发明涉及一种诺如病毒VP1融合蛋白及表达方法，属于重组蛋白技术领域。诺如病毒VP1融合蛋白的表达方法包括以下步骤：将A蛋白的N端与B蛋白的C末端连接形成融合蛋白，所述A蛋白为GII型诺如病毒的高表达VP1蛋白，所述B蛋白为另一种GII型诺如病毒的VP1蛋白。利用重组杆状病毒表达系统表达表现为不表达、低表达或者组装效率低的VP1蛋白的C末端和高表达VP1蛋白N端骨架连接形成融合蛋白，根据昆虫细胞密码子使用频率对融合蛋白序列进行优化合成，然后利用重组杆状病毒表达系统进行表达，其表达量大大提高，融合蛋白也保留了C末端来源VP1蛋白的HBGA结合特性和免疫原性。

技术领域

本发明属于重组蛋白技术领域，具体涉及一种诺如病毒VP1融合蛋白及表达方法。

背景技术

诺如病毒（Noroviruses，NoVs），也称为诺瓦克样病毒（Norwalk-like viruses），是目前引起非细菌性急性肠胃炎的最主要病原体。NoVs属于杯状病毒科（Caliciviridae），诺如病毒属（Norovirus），无包膜、单正链RNA病毒，基因组全长约7.5～7.7 kb。人NoV基因组共含有三个开放阅读框（open reading frame，ORF），即ORF1-ORF3，其中ORF1编码一个多聚蛋白体，在翻译中或者翻译后被病毒蛋白酶剪切为六个非结构蛋白（NS1/2-NS7），而ORF2和ORF3分别编码主衣壳蛋白（major capsid protein）VP1和次衣壳蛋白（minor capsidprotein）VP2。利用体外（In Vitro）表达系统表达的VP1可以自组装成病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），其形态和免疫原性与野毒株相似（Huo et al., 2018, Jiang etal., 1992）。根据VP1核苷酸序列可以将NoV分为至少十个基因组型（genogroup），即GI-GX，其中的GI、GII、GIV、GVIII和GIX感染人类（Chhabra et al., 2019）。每种基因组型又可以划分为多个不同的基因型（genotype），如GI型包括9个基因型，GII型包括27个基因型。感染人类的大部分分离株属于GI和GII，其中GII.4是目前的主要流行株，引起了约80%的感染病例（Vinjé, 2015, Afeworket al., 2022）。

利用重组杆状病毒表达系统以及其它真核或原核表达系统表达的VP1蛋白可以在胞内自组装成形态和免疫原性与野毒株相似的VLPs。虽然近年来NoVs研究取得了显著的进展，如发现肠道细菌可以促进NoVs感染B细胞，鼠源性NoVs蛋白受体的发现以及体外NoVs培养方法的建立等等（Ettayebi et al., 2016, Graziano et al., 2020, Jones et al.,2014, Lei et al., 2019），但是截至目前仍然没有发现一种高效的体外NoVs培养方法，基于NoVs的疫苗研发主要依赖于VP1蛋白。VP1蛋白是NoVs的主要结构蛋白，参与了病毒结构组装、与宿主间的相互作用以及免疫应答的产生等生物学功能。根据X-射线晶体衍射技术和3-D结构解析，VP1蛋白可以分为相互独立的shell domain（壳区，S）和Protrudingdomain (突环区，P)，而P区又可以划分为P1区和P2区（Prasad et al.,1999, Prasad etal., 1994）。P2区介导了与人组织血型抗原（histo-blood group antigens, HBGAs）的结合，而HBGA是目前公认的NoVs受体或共受体。

目前有多种表达系统可以用于NoVs的 VP1蛋白的表达，使用最多的是昆虫细胞表达系统、重组酵母和大肠杆菌表达系统，原因是这三个表达系统比较成熟且有相关的疫苗上市，如基于三个表达系统的HPV疫苗。但无论使用哪种表达系统，不同分离株都会面临蛋白不表达或者表达量低的情况，特别是针对NoVs这种高变异RNA病毒，不同时期可能需要根据流行情况对表达的VP1蛋白进行调整，这就给疫苗研发带来一定的难度，因此寻找一种相对比较稳定的VP1蛋白高表达方法，不仅有助于疫苗开发，也有助于推动基础研究的开展。

发明内容