[发明专利]一种京巴犬口腔肿瘤细胞系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种京巴犬口腔肿瘤细胞系及其构建方法。通过离体的犬口腔肿瘤组织的原代培养，成功构建了京巴犬口腔肿瘤细胞系并冻存，将其命名为PETCC#143，其保藏编号为CGMCC NO:45542。本发明所述的京巴犬口腔肿瘤细胞系呈贴壁状态，胞体梭形或不规则三角形，中有卵圆形核，胞质向外伸出2‑3个长短不等的细胞突起，贴壁细胞可见1‑3个核仁，适用于探索犬口腔肿瘤治疗尤其是化疗、放疗等方式和方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种京巴犬口腔肿瘤细胞系及其构建方法。

背景技术

近年来，肿瘤在犬（Canis lupus familiaris）中的发生率日益增高，而其中口腔肿瘤的发生比率在犬约占所有肿瘤的6%，犬恶性口腔肿瘤占犬肿瘤的5.3%。口腔是犬猫临床第四大肿瘤易发部位，易早期侵犯临近重要器官，如眼、颅底、颈部等。口腔肿瘤常给患犬带来痛苦，患犬表现出进食困难、口周疼痛、牙齿松动、口腔异味、流涎，继而导致体重丢失，严重者会发生持续性或周期性的口腔出血，有时肿瘤占位较大，可见面部不对称，以及咬合不正等等。犬口腔肿瘤中最常见的有恶性黑色素瘤、纤维肉瘤以及鳞状细胞癌。目前，犬的口腔肿瘤治疗一般预后差，肿瘤易发生转移，平均术后存活寿命为1年左右。故此，一种京巴犬（Pekingese）口腔肿瘤细胞系的建立对于犬的口腔肿瘤研究具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种京巴犬口腔肿瘤细胞系，命名为PETCC#143，该细胞系已于2023年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号为CGMCC NO:45542，该细胞系可在体外连续传代培养而保持遗传稳定性。

本发明所提供的京巴犬口腔肿瘤细胞系来源于14岁的绝育后的雌性京巴犬口腔肿瘤组织。

本发明提供上述可以稳定遗传的京巴犬口腔肿瘤细胞系的构建方法，包括：

获取京巴犬口腔肿瘤组织；将肿瘤组织放在6孔板中，将肿瘤组织用组织匀浆器打碎至肉糜状；取肉糜置于离心管中，加入消化液轻柔颠倒混匀；置于摇床中振荡消化；将红细胞裂解；收获细胞悬液并接种；传代；冻存。

进一步，所述获取京巴犬口腔肿瘤组织包括手术取下京巴犬的口腔肿瘤组织，用含双抗的PBS浸没后转移至生物安全柜。

进一步，所述将肿瘤组织放在6孔板中，将肿瘤组织用组织匀浆器打碎至肉糜状包括将肿瘤组织放在6孔板中，重复用干净的PBS浸洗5次，用组织匀浆器将肿瘤组织打碎至肉糜状，用少许PBS浸润。

进一步，所述取肉糜置于离心管中，加入消化液轻柔颠倒混匀包括用移液枪配合剪过的1ml枪头将组织肉糜吸取转移至15ml离心管中，按250：1的比例加入胶原酶IV，轻柔颠倒离心管混匀。

进一步，所述置于摇床中30min振荡消化包括将含组织肉糜的离心管封好，放入摇床中，200rpm，37℃条件下振荡消化30min。

进一步，所述将红细胞裂解包括以下步骤：

步骤一：取出离心管后，在生物安全柜中用40um筛网过滤至50ml离心管；

步骤二：将离心管放至离心机中，2000rpm，4℃离心5min；

步骤三：弃上清，用5mlACK重悬细胞，静置1min；

步骤四：将离心管放至离心机中，1800rpm，4℃离心5min。

进一步，收获细胞悬液并接种包括以下步骤：

步骤一：将离心管转移至生物安全柜，弃上清，用大量PBS重悬沉淀；

步骤二：将悬液用40um筛网过滤至50ml离心管中；