[发明专利]一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法

权利要求书

1.一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，

首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞；

接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；

然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；

再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。

2.根据权利要求1所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：取自体脂肪组织，剪碎，得到脂肪颗粒；将脂肪颗粒用生理盐水重悬、离心，得到白色沉淀；对白色沉淀进行培养，得到脂肪干细胞。

3.根据权利要求2所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：在无菌状态下抽取脂肪组织，PBS漂洗后充分剪碎至糊状，加入Ⅰ型胶原酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；终止消化后离心，去上清液及未消化的脂肪，少量培养基重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，离心后得到单个核细胞；经过计数后进行传代培养，即可得到脂肪干细胞。

4.根据权利要求1所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，子宫内膜间充质干细胞的制备步骤如下：体外收集经血，并制备经血采集液；经血混合液经过过滤、离心处理，得到单个核细胞；对单个核细胞进行培养，得到子宫内膜干细胞。

5.根据权利要求4所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，将采集管中的经血混合液充分混匀后用100μm的细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后用PBS漂洗，加入胰蛋白酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。

6.根据权利要求5所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，经血和经血采集液的体积比为1:1-5；每100ml的经血采集液包括0.1-0.3％的青霉素、0.1-0.3％的链霉素、0.1-0.3％的头抱氨苄、450单位肝素、0.5-1.0mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF、低于0.8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64、0.3-0.75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA和余量的生理盐水。

7.根据权利要求1所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，进行自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞共培养时每2天更换干细胞培养液，4-6天传代一次。

8.根据权利要求8所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，共培养方法为：吸去原有培养液，将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液1:1混合，转移至STO细胞饲养层上培养。

9.根据权利要求8所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，共培养时还需要加入20％的血清替代品、2mmol/L谷氨酞胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、100mg/mL链霉素、1％的非必需氨基酸、2.5μmol/L BIO、5-10ng/ml碱性成纤维生长因子和1％的ITS。