[发明专利]FRET荧光蛋白探针及其应用

说明书

本发明提供了一种FRET荧光蛋白探针，包括Lssmorange、mKate2和连接多肽，该连接多肽的两端分别连接Lssmorange和mKate2，其中，所述连接多肽包括如SEQ ID NO:1～9所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种基于上述FRET荧光蛋白探针的重组质粒及转化体。本发明还提供了一种新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂筛选模型及方法，主要利用SARS‑COV‑2 Mpro蛋白液对上述荧光蛋白探针的水解作用，引起的荧光强度的变化来筛选新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂。所以，上述FRET荧光蛋白探针容易识别出SARS‑COV‑2 Mpro抑制剂药物筛选中的假阳性；在细胞内可表达，可以在细胞水平对SARS‑COV‑2 Mpro抑制剂进行筛选；从而使得采用上述荧光蛋白探针的新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂筛选模型及方法，提高了SARS‑COV‑2 Mpro抑制剂筛选的准确性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种FRET荧光蛋白探针及其在筛选抗新型冠状病毒药物中应用。

背景技术

虽然新型冠状病毒疫苗预防重症或死亡病例的保护效果显著，但由于毒株的不断变异和进化，疫苗并不能完全阻止病毒的传播及感染。因此开发安全有效的新型冠状病毒治疗药物仍是重中之重。

SARS-CoV-2属于套式病毒目冠状病毒科的亚科中的β属冠状病毒，基因序列的2/3在宿主细胞的内质网中转化成pp1ab与pp1a蛋白,主蛋白酶(Mpro，也称为3CL-pro)可切割pp1ab与pp1a蛋白产生非结构蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶和解旋酶等，这些非结构蛋白负责病毒基因组的复制和转录，还在病毒的其他重要生命过程中发挥作用，如蛋白质翻译、裂解、修饰和核酸合成，其对于新型冠状病毒复制具有重要的生物学功能。

目前，对于基于荧光共振能量转移技术对新型冠状病毒Mpro抑制剂的高通量筛选体系多以多肽探针为底物，无法识别由于蛋白质变性而导致得酶失活，从而产生较多的假阳性。此外，多肽探针的FRET成本较高，无法用于细胞水平药物的筛选。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一提供一种FRET荧光蛋白探针，该探针通过柔性连接多肽（Linker）连接荧光蛋白Lssmorange（以下简称“Ls”）和mKate2（以下简称“mK”），当药物使目的蛋白变性时也可使荧光蛋白变性，可以容易识别出筛选中的假阳性，提高了药物筛选的准确性，并且可以用于细胞水平的抑制剂筛选。

本发明的目的之二提供一种基于上述FRET荧光蛋白探针的重组质粒和转化体，使得上述FRET荧光蛋白探针转入现有的表达载体中进行转化表达，制备容易，获得探针的成本低，克服了高通量筛选成本高的缺点。

本发明的目的之三通过构建一种基于荧光蛋白探针的FRET高通量筛选模型，实现了FRET荧光蛋白探针在筛选抗新型冠状病毒药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种FRET荧光蛋白探针，包括Lssmorange、mKate2和连接多肽，该连接多肽的两端分别连接Lssmorange和mKate2，其中，所述连接多肽包括如SEQ ID NO: 1～9所示的氨基酸序列。

具体地，所述连接多肽的氨基酸序列为：GGSGSG（KTSAVLQSGFRKM）SGGSGGSG、SG（KTSAVLQSGFRKM）SG及类似结构(GGSGG)nKTSAVLQSGFRKM(GGSGG)n，n为1、2、3、4、5、6、7。

根据荧光蛋白基团在上述荧光蛋白探针中的排列位置不同，所述荧光蛋白探针为Lssmorange-连结多肽-mKate2或者mKate2-连结多肽-Lssmorange。

一种重组质粒，包括重组载体和克隆入该重组载体的上述荧光蛋白探针的编码基因。优选地，所述重组载体为原核表达载体和真核表达载体，可以大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。