[发明专利]一种以氢氧化钙为中和剂结合CO2

说明书

本发明提供了一种以氢氧化钙为中和剂结合COsubgt;2/subgt;脉冲反馈补料发酵生产丁二酸的方法，所述方法包括：将发酵菌株WS100活化后，依次进行一级种子培养、二级种子培养，获得二级种子液；将所述二级种子液进行发酵罐培养生产丁二酸，其中，所述发酵罐培养阶段进行如下操作：在所述发酵罐培养的初期，监测发酵液pH值，待发酵液pH值自然下降至5～6.5时，加入质量分数为22～24％氢氧化钙溶液作为中和剂直至pH值升至7.5～9停止添加；后通入二氧化碳气体直至pH值降到6.5～7时停止以使发酵液自然发酵；当发酵液中丁二酸的不断累积使pH值自然下降至5～6.5时再重复上述操作。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种以氢氧化钙为中和剂结合CO₂脉冲反馈补料发酵生产丁二酸的方法。

背景技术

丁二酸作为化工中间体的合成前体，广泛应用于食品、化工、医药及可降解生物材料等领域。近年来通过不断对生物发酵生产丁二酸的菌种改良(中国专利CN 104178443A；CN 102827800A)，生物发酵生产丁二酸的工艺正逐步成熟，并进行了产业化方面应用，但仍然有一些基于成本考虑等因素，如中和剂的选择及产物分离纯化问题，妨碍了生物法合成丁二酸的应用进程。

目前有机酸发酵常用的几种中和剂，在丁二酸发酵生产中也都被广泛的使用。相比而言，基于碳酸镁的中和剂，普遍被认为最能提高丁二酸的发酵产量及生产强度(代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺，微生物学通报，2018,45(12):2541-2551；大肠杆菌FMME～N～26生产琥珀酸的发酵条件优化和放大，过程工程学报.2022,22(7)：854～862)。基于碳酸镁的中和剂作为碱性试剂，不但通过碱性中和发酵过程中产生的丁二酸，避免酸对发酵生物的毒害，还因为镁离子是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的辅助因子从而促进了丁二酸的积累，中和过程中所生成的CO₂更能被发酵中间产物丙酮酸/磷酸烯醇式丙酮酸固定化，促进了丙酮酸/磷酸烯醇式丙酮酸流向丁二酸合成途径，提高了丁二酸产量。镁离子中和剂的缺点也是显而易见的，目前碳酸镁的价格高，与碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、碳酸钙、碳酸氢钙及氢氧化钙等价格相比，很难占到优势。此外游离的镁离子对后续的产物分离纯化工艺也带来了挑战，作为二价阳离子，对后续的离子交换或电渗析技术都带来了沉重的负荷，从而使分离的成本居高不下。

氢氧化钙作为传统的有机酸发酵中和剂，具有成本低和配套工艺成熟的特点。所生成的丁二酸钙在加硫酸的条件下，很容易生成硫酸钙沉淀而去除发酵液中的钙离子，发酵后续的产物分离纯化工艺简单，大大降低了丁二酸生产成本。但丁二酸发酵时采用氢氧化钙作为中和剂，发酵产量及糖酸转化率往往较其它中和剂低，如果改用碳酸钙或者碳酸氢钙作为中和剂，固然能在发酵过程中补充丁二酸发酵所需的前体CO₂，但又面临着中和剂碱性较弱，无法迅速调整发酵液pH的问题。

因此，需要提供一种发酵生产丁二酸的方法既能提高丁二酸发酵糖酸转化率的同时，又能明显降低发酵和后续分离纯化成本。

发明内容

本发明目的是提供一种以氢氧化钙为中和剂结合CO₂脉冲反馈补料发酵生产丁二酸的方法，氢氧化钙为中和剂结合CO₂脉冲反馈补料发酵可提高丁二酸发酵糖酸转化率的同时，明显降低发酵和后续分离纯化成本。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种以氢氧化钙为中和剂结合CO₂脉冲反馈补料发酵生产丁二酸的方法，所述方法包括：

将发酵菌株WS100活化后，依次进行一级种子培养、二级种子培养，获得二级种子液；

将所述二级种子液进行发酵罐培养生产丁二酸，其中，所述发酵罐培养阶段进行如下操作：