[发明专利]一种从梅花鹿粪便中提取宿主核基因组DNA的方法及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从梅花鹿粪便中提取宿主核基因组DNA的方法。该方法将梅花鹿粪便样品置于无水乙醇中，然后进行离心震荡洗脱，得到洗脱液；向洗脱液中加入醋酸钠溶液，混匀，离心，得到富集的梅花鹿肠壁细胞及破碎肠壁细胞释放的宿主DNA；然后通过75％乙醇清洗，离心，干燥，得到收集物；最后使用微量DNA提取试剂盒从收集物中提取梅花鹿核基因组DNA。本发明的方法操作简单，高效可靠，耗时短，成本低，通过使用无水乙醇对梅花鹿粪便表明附着的肠壁细胞进行洗脱，显著增加了梅花鹿肠壁细胞及其DNA的收集量，同时在洗脱过程保证粪球的完整性，最大限度减少了细菌DNA对梅花鹿核基因组DNA的污染。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从梅花鹿粪便中提取宿主核基因组DNA的方法。

背景技术

梅花鹿(Cervusnippon)隶属于偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Cervidae)鹿属，是东亚季风区特产鹿类，国际濒危物种，我国I级保护动物。历史上，梅花鹿曾广泛分布于亚洲东北部，共记录有13个亚种。我国曾分布有6个亚种，分别为山西亚种(C.n.grassianus)、河北亚种(C.n.mandarinus)、东北亚种(C.n.hortulorm)、四川亚种(C.n.sichaunicus)、华南亚种(C.n.kopschi)和台湾亚种(C.n.taioanus)。其中山西亚种、河北亚种和台湾亚种的野外种群已经灭绝，我国目前仅存东北亚种、四川亚种和华南亚种3个亚种，总数量1000余只，且零散分布于我国四川、江西、浙江等省的狭窄区域，分布区相互隔离。在种群数量上，除四川铁布保护区和江西桃红岭保护区的种群外，其它种群均低于理论最小种群数500只，依然面临种群灭绝风险。因此，开展野生梅花鹿种群保护遗传学研究，对于掌握其种群遗传结构和遗传变异水平，从而制定精确有效的保护管理措施，确保其种群健康快速发展具有重要意义。目前国内对于梅花鹿种群遗传多样性的研究几乎只限于东北亚种的人工饲养种群，野生梅花鹿种群由于血液、肌肉等组织样品采集困难，其保护遗传学研究难以全面深入开展。

近年来，非损伤性取样因为可以在不伤害野生动物的情况下获取分析所需的DNA，因此在野生动物保护遗传学、分子生态学和分子进化等领域获得了广泛应用。其是指在不捕获、触及，甚至在未见到动物的情况下，收集动物毛发、粪便、尿液、脱落羽毛、含口腔脱落细胞的食物残渣、鳞片以及卵壳等样品，从中获取动物DNA的方法。有研究表明，每克哺乳动物粪便中含有1×10⁵～1×10⁶个宿主肠壁细胞，且大部分肠壁细胞依然保持完整，因此粪便是在不损伤野生哺乳动物条件下获取其遗传物质的有效途径。但动物粪便样品的成分相较于血液和组织样品复杂的多，其包含了大量的食物残渣和细菌，宿主脱落的肠壁细胞只占其中极其微小的一部分。所以直接从粪便中提取的DNA只含有极少量的宿主DNA，而且其中包含了多种PCR反应抑制物质，因此难以直接应用于宿主的遗传学分析。