[发明专利]重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用

说明书

本发明涉及人三型胶原蛋白技术领域，具体重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用。通过构建重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株，通过该菌株诱导表达可得到该重组人三型胶原蛋白，不仅表达量可达到5g/L，而于菌株胞外表达，诱导表达条件宽泛，易于分离纯化；得到的重组人三型胶原蛋白能够作用医用美容产品的原料，前景可观。

技术领域

本发明涉及人三型胶原蛋白技术领域，具体重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用。

背景技术

胶原蛋白由原胶原组成，每个原胶原都有一种特殊的三重螺旋结构，由3条α螺旋的肽链缠绕而成，长度约为1000个氨基酸残基；每条α肽链通过左手螺旋缠绕，3条肽链一起形成一个大的右手螺旋结构。Nokelainen等构建了两株杆状病毒表达系统，其中一株编码人Ⅲ型原胶原α1链，另一株编码人P4H的α和β亚基，通过共感染昆虫细胞，成功表达了人胶原蛋白，并具有稳定三螺旋结构，表达量达50mg/L。由于动、植物细胞的培养难度大，成本高，想要大规模生产不太理想。因此，采用微生物作为宿主仍然是较为理想的选择。

Vuorela等于1997年成功利用毕赤酵母表达了人Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白全序列。大量研究表明胶原蛋白与关键酶P4H在宿主细胞的共表达是一个较好的策略。使用α-MF信号肽也只能够极少量地提高其分泌量，同时又会减少Ⅰ型胶原蛋白的表达总量。重组酵母表达得到的胶原分子其结构、性质等都接近于天然的胶原蛋白，同样也能在体外组装成胶原纤维，仅四基因的单拷贝重组子的胶原蛋白表达量就高达0.5g/L，比在同样条件下表达Ⅰ型胶原蛋白提高了1.5～3倍。

发明内容

本发明人利用人源胶原蛋白III型a1链目的基因的两端目的基因M1和M2与一段目的序列M3融合构建了重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株，不仅表达量可达到5g/L，而于菌株胞外表达，诱导表达条件宽泛，易于分离纯化；得到的重组人三型胶原蛋白能够作用医用美容产品的原料，前景可观。

第一方面，本发明提供了一种重组人三型胶原蛋白的制备方法，包括：

构建重组人三型胶原蛋白的重组表达质粒；

将所述重组质粒转入毕赤酵母，得到重组菌株；以及

对所述重组菌株进行诱导表达，收集发酵液，纯化即可得到所述重组人三型胶原蛋白；

其中，所述重组表达质粒的构建包括：

构建质粒pUC57-M3；

依据所述质粒pUC57-M3构建质粒pUC57-M3-M1；

依据质粒pUC57-M3-M1构建质粒pUC57-M3-M1-M2；

依据质粒pUC57-M3-M1-M2构建重组表达质粒pPICZαA-M3-M1-M2；

其中，M1、M2、M3的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示。

其中，构建质粒pUC57-M3的步骤包括：

对M3序列进行PCR扩增，得到携带pUC57同源臂的M3序列；

对pUC57采用SacI和BSP681进行使用的双酶切反应，得到pUC57的线性化序列；

将携带pUC57同源臂的M3序列与pUC57的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒pUC57-M3。

在M3序列进行PCR扩增过程中，采用M3-F和M3-R为引物对，M3-F和M3-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～5所示。

其中，“依据所述质粒pUC57-M3构建质粒pUC57-M3-M1”的步骤包括：