[发明专利]一种神经酰胺衍生化测定方法

说明书

本发明涉及生物检测技术，具体涉及一种神经酰胺衍生化测定方法，包括以下步骤：S1衍生化反应：将待测物与6‑氨基喹啉基‑N‑羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)衍生试剂反应；S2色谱分离：采用C18色谱柱分离；S3计算：荧光或紫外检测，外标法计算样品中神经酰胺含量。本发明与其他衍生化方法相比，不需要先将神经酰胺进行脱酰基反应，本发明将神经酰胺标样或样品直接与AQC进行衍生化反应，具有操作简便、样品衍生化步骤少、反应时间短衍生化产物稳定的优点。

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体涉及一种神经酰胺衍生化测定方法。

背景技术

神经酰胺(ceramide)，是由长链鞘氨醇通过酰胺键与脂肪酸共价结合而成，按其饱和度和羟基含量的不同分成7种即ceramide(Ⅰ)～ceramide(Ⅱ)，可由鞘磷脂酶水解鞘磷脂或从头合成或由鞘氨醇转化而来。在结构上为鞘磷脂(细胞膜的组成成分)的基本单位，也是皮肤角质层的重要组分。在功能上作为体内的重要生物活性物质，具有保湿、调节免疫、抗过敏、抗衰老等多种功能，尤其是作为脂质第二信使发挥多种重要作用如调控细胞周期与细胞分化、诱导细胞凋亡等，是细胞内氧化应激通路的关键信号分子，参与诸多病理生理过程，广泛用于医药保健、食品和化妆品等行业，并且新的用途不断被揭示，已引起广泛关注。

随着神经酰胺的应用越来越广泛，人们对神经酰胺的研究也越来越深入，而高效可靠的分析方法是进行神经酰胺深入研究的基础。由于神经酰胺在实际样品中的含量很低，且不含有紫外生色团，故不能使用常规的紫外检测器检测；采用蒸发光散射检测器时，由于检测器响应值与待测物的质量关系曲线较为复杂，不呈线性关系，导致定量检测比较困难。近年来质谱法也被应用于神经酰胺的检测，但由于仪器昂贵的局限性而不能广泛应用。

采用柱前衍生化方法是检测神经酰胺的有效手段，文献报道的检测方法有苯甲酰化-紫外检测法、邻苯二甲醛(OPA)衍生-荧光检测法等。苯甲酰化-紫外检测法利用苯甲酰化试剂与神经酰胺进行衍生反应，生成在230-280nm处有很强的紫外吸收的N-酰基化合物，从而实现对神经酰胺的紫外检测。该方法步骤繁琐，衍生化反应需1个小时，且衍生化产物稳定性低，易受其他物质的干扰。OPA衍生法具有衍生反应时间短，室温即可反应等优点，但OPA只能与伯胺类物质进行反应，通过脱酰基反应将神经酰胺转变为自由鞘胺醇，脱酰基反应是将样品或标样在碱性条件下在沸水浴反应2h，这将加大样品的处理时间。因此有必要建立一种样品处理步骤少，快速准确的神经酰胺定量检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经酰胺衍生化测定方法，以解决现有技术处理步骤多，检测时间长的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种神经酰胺衍生化测定方法，包括以下步骤：

S1衍生化反应：将待测物与6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)衍生试剂反应；

S2色谱分离：采用C18色谱柱分离；

S3计算：荧光或紫外检测，外标法计算样品中神经酰胺含量。

作为优选，所述S1步骤在pH8.5的硼酸缓冲液体系中，待测物与AQC溶液等体积在55-60℃下反应15-18分钟。

作为优选，所述S2步骤色谱条件为采用C18色谱柱，以甲醇(A)-0.05％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～20min，50％A→100％A；20～30min，100％A)，流速1.0mL/min，荧光检测器的激发波长和吸收波长分别为250nm和395nm，紫外检测器波长为254nm，柱温为30℃，进样量为10μL。