[发明专利]一种高产β-榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法

权利要求书

1.一种高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：包括，

选择β-榄香烯从头生物合成效率高的合成酶；

通过过表达酶ispA提高β-榄香烯的产量_；

再通过RBS工程或蛋白融合技术进一步提高β-榄香烯的产量_；

改写中心碳代谢途径提高前体积累；

高通量筛选定向进化酶NS，获取高活性的NS酶；

代谢调控回流积累的丙酮酸提高β-榄香烯的产量；

调节外排泵促进β-榄香烯的产生；

构建得到高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌。

2.如权利要求1所述的高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述合成酶包括来自香椿、水稻和Nostocsp.PCC7120的合成β-榄香烯合成酶基因TS(NCBIAccessionnumber:AB730585)，OS(NCBIAcce ssionnumber:ABJ16553)和NS(NCBIAccessionnumber:BAB76384)，序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3。

3.如权利要求1所述的高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述过表达酶ispA提高β-榄香烯的产量，包括，将携带过表达大肠杆菌的基因ispA的pRSF-INI质粒和携带合成β-榄香烯和germacreneA的代谢途径的质粒pA-ESKKD共转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中；

其中，所述质粒pA-ESKKD的序列如SEQ ID NO：4所示。

4.如权利要求1所述的高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述通过RBS工程提高β-榄香烯的产量，包括，使用RBS计算器生成酶NS的电子RBS库，将这些具有500个任意单位(au)至50000au的翻译起始速率(TIR)的RBS工程序列添加到NS的5’端以产生质粒pRSF-INI。

5.如权利要求1所述的高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述通过蛋白融合技术提高β-榄香烯的产量，包括，融合ispA和NS两种酶用四种不同的连接子将1类非植物合酶NS的N末端分别采用短链连接子、中链连接子、长链连接子和柔性链连接子与内源ispA的C末端融合，短链GGGS，中链(GGGS)2，长链(GGGS)3，柔性链GGGGS。

6.如权利要求1所述的高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述改写中心碳代谢途径提高前体积累，包括，

基于野生菌EscherichiacoliBL21(DE3)依次敲除基因丙酮酸脱氢酶(pox B)、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA)、葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶(pt sG)、磷酸转移酶系统的葡萄糖特异性酶IIA组分(crr)、乙酰醛辅酶A脱氢酶(adhE)、D-乳酸脱氢酶(ldhA)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)，得到大肠杆菌缺陷菌ΔpoxBΔppsAΔptsGΔcrrΔadhEΔldhAΔzwf；并过表达半乳糖渗透酶(galP)和葡萄糖激酶(glk)；

其中，所述敲除的基因poxB的序列如SEQ ID NO：5所示；

所述敲除的基因ppsA的序列如SEQ ID NO：6所示；

所述敲除的基因ptsG的序列如SEQ ID NO：7所示；

所述敲除的基因crr的序列如SEQ ID NO：8所示；

所述敲除的基因adhE的序列如SEQ ID NO：9所示；

所述敲除的基因ldhA的序列如SEQ ID NO：10所示；

所述敲除的基因zwf的序列如SEQ ID NO：11所示。