[发明专利]基于对向照明的光学衍射层析显微成像方法

说明书

本发明公开了一种基于对向照明的光学衍射层析显微成像系统及方法，所述方法采用LED阵列作为正向角度扫描照明光源，通过依次点亮LED从不同角度照射样品，采集一系列正向角度扫描照明下的样品强度图；然后采用超连续谱激光器作为后向波长扫描照明光源，通过声光可调协滤波器进行滤波产生不同波长的光照射样品，采集一系列后向波长扫描照明下的样品强度图。本发明采用非干涉傅里叶叠层方法将对向采集到的强度图像迭代更新到三维散射势谱中，不受散斑和寄生干涉的影响，直接恢复恢复样品的三维折射率分布。

技术领域

本发明属于光学显微测量、三维折射率成像技术，具体为一种基于对向照明的光学衍射层析显微成像方法。

背景技术

在生物医学显微成像领域，大部分活细胞和未染色的生物标本都是无色透明的，这是因为细胞内各部份细微结构的折射率和厚度的不同，当光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化，但这种相位差人眼无法观察。这就需要通过一些化学或者生物手段来对细胞进行染色，从而使其在显微镜下可见。由于生物细胞内部不同物质对有色染料吸收的吸收率不同，故最终在显微镜下就可以看见生物细胞内部的结构和表现出不同的生物特性。

光学衍射层析成像(Optical Diffraction Tomography,ODT)是一种显微成像技术，它利用生物样品的内源性特性—折射率，实现细胞特征的三维可视化或定量表征。与共焦显微镜和光片显微镜等非相干荧光成像技术相比，光学衍射层析成像技术有效地避免了生物样品中荧光染料的光毒性和光漂白，并实现了无创、无标记的三维体积成像。因此，它已广泛应用于生物物理学、细胞生物学、血液学和微生物学。然而，传统透射光学衍射层析显微镜中的一个关键挑战是，由于单个物镜的数值孔径所施加的有限投影角，无法测量沿轴向的某些空间频率分量。这种限制通常被称为缺失锥体问题，导致轴向分辨率比横向分辨率差几倍，并严重阻碍折射率值的重建精度。

光学衍射层析成像技术中为了记录单个物镜孔径极限之外的特征频率，解决缺失锥问题提高轴向分辨率通常有三种手段。(1)通过旋转样本来填充缺失的锥体(Lee M,KimK,Oh J,et al.Isotropically resolved label-free tomographic imaging based ontomographic moulds for optical trapping[J].Light:ScienceApplications,2021,10(1):102.)。这种类型的重建具有复杂的实验装置，因为需要定制的样品台和样品绕固定轴或在微流体通道(Merola F,Memmolo P,Miccio L,etal.Tomographicflow cytometrybydigital holography[J].Light:ScienceApplications,2017,6(4):e16241-e16241.)中的旋转。因此，这些方法几乎不适用于粘附在基质上生长的细胞，对于活细胞的长期观察并不理想。(2)使用正则化约束(Lim J W,Lee K R,Jin K H,etal.Comparativestudyofiterative reconstruction algorithms for missing cone problems inoptical diffraction tomography[J].Optics express,2015,23(13):16933-16948.)或深度学习(Chung H,Huh J,Kim G,et al.Missing cone artifact removal in ODT usingunsupervised deep learning in the projection domain[J].IEEETransactions onComputational Imaging,2021,7:747-758.)缓解缺失锥体问题。然而，这种类型的方法基于样品折射率分布以及实验仪器固有属性的先验知识，忽略了光与被测样品之间的物理相互作用，因此在真实、复杂的细胞样品情况下缺乏通用性。(3)使用透射光学衍射层析结合反射光学相干层析(Optical Coherence Tomography,OCT)解决缺失锥问题(Krauze W,Ossowski P,Nowakowski M,etal.Enhanced QPI functionality bycombining OCTandODT methods[C].Quantitative Phase Imaging VII.SPIE,2021,11653:19-24.)。然而虽然反射光学相干层析技术确实可以接收用于填充轴向光谱的反向散射场，但它仅适用于生成强反向散射信号的强散射样本，这与我们光学衍射层析中测量的对象的弱散射条件相冲突。并且，光学相干层析技术依赖干涉测量，会引入额外的干涉噪声，并且需要搭建干涉所需的参考光路，难以耦合到现有的商用显微技术中。