[发明专利]一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法

说明书

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法。方法为将表达菌株的种子液接种至发酵罐中，于32‑37℃下开始发酵，待发酵液ODsubgt;600/subgt;值≥3时，加入培养保护液，提高发酵温度至40‑42℃，开始升温诱导，直至发酵结束；培养保护液包括100g/L海藻糖和100g/L谷氨酸钠。本发明在升温诱导时添加培养保护液，可高效表达可溶性VP2蛋白，蛋白效价可得到3‑4倍的提高，且培养基成本低廉，发酵工艺简单易行，为工业化生产VP2疫苗奠定了坚实的基础。

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，该病毒主要侵害雏鸡和青年鸡的淋巴组织，尤其是法氏囊等中枢免疫器官，可造成法氏囊组织出现严重病理损伤，进而导致机体发生严重的免疫抑制，极易导致继发感染或使多种疫苗免疫失败，给养鸡业造成巨大的损失。

IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，基因组由两个长度不相同的双股RNA（Double-strand RNA，dsRNA）组成。A节段编码一个110kDa的多聚蛋白和一个17kDa的非结构蛋白（NS或者VP5）。多聚蛋白被翻译出后，由蛋白水解酶VP4剪切成pVP2（49kDa），VP3（32kDa）和VP4（28kDa）。VP2和VP3是病毒主要的结构蛋白，其中VP2蛋白占蛋白总含量的51%，位于病毒粒子的外表面，与抗原性和毒力的变异、细胞嗜性、致病性、细胞凋亡等密切相关，具有IBDV所有的中和表位，诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV感染。目前，已有相关研究人员基于大肠杆菌、重组火鸡疤疹病毒、酵母、禽痘病毒等表达系统开发基因工程疫苗。但都存在以下缺陷，如大肠杆菌表达的VP2蛋白多以包涵体形式存在，必须经过变性复性，另外，大肠杆菌表达的VP2抗原往往采取IPTG诱导方式，但IPTG有一定毒性，重组活载体疫苗不仅存在实验室和生产过程中的安全问题，并且其与普通活疫苗一样发生基因突变和重组的几率较高。因此研制一种生产成本低、安全效率高、能可溶性表达并具备良好免疫原性的基因工程疫苗，具有重要的现实意义。

目前，已有将温控表达蛋白方法应用于禽法氏囊病VP2发酵生产的相关研究。程太平等人采用摇瓶培养进行了优化分析，但琼扩效价低，潘群兴等人对VP2基因进行了密码子优化，但表达蛋白主要以包涵体为主，且没有进行效价检测；王海波等人采用发酵罐温控表达粒菌体集落刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF）。但目前仍缺乏采用发酵罐温控表达VP2蛋白的工业化生产相关研究。

发明内容

针对传统IPTG诱导方式使用有毒试剂的技术问题，本发明提供一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法，在升温诱导时添加培养保护液，可高效表达可溶性VP2蛋白，蛋白效价可得到3-4倍的提高，且培养基成本低廉，发酵工艺简单易行，为工业化生产VP2疫苗奠定了坚实的基础。

本发明技术方案如下：

一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法，将表达菌株的种子液接种至发酵罐中，于32-37℃下开始发酵，待发酵液OD₆₀₀值≥3时，即菌体处于对数生长前期时，加入培养保护液，提高发酵温度至40-42℃，开始升温诱导，直至发酵结束；

培养保护液包括100g/L海藻糖和100g/L谷氨酸钠。

进一步的，培养保护液的加入量≥10mL/1L发酵体积。

进一步的，升温诱导1-5h后结束发酵。

进一步的，初始发酵温度为35℃，升温诱导为42℃，升温诱导3-4h后结束发酵。