[发明专利]一种喀斯特高原湖泊水环境DNA样品的现场采集方法

说明书

本发明公开了一种喀斯特高原湖泊水环境DNA样品的现场采集方法，包括以下步骤：第一步，工作人员在采样前须佩戴一次性无菌手套，在采样点充分润洗采水器和塑料桶3~5次；第二步，用采水器采集水样并倒入润洗过的塑料桶内，装2 L水于无菌广口瓶中，随后立即进行低温避光保存处理；第三步，使用隔膜真空泵和砂芯玻璃过滤装置抽滤水样；第四步，抽滤工作完成后，水样中的eDNA富集于滤膜上，用镊子将滤膜卷起置于无菌离心管中在‑20℃条件下保存。该发明结合喀斯特高原湖泊特殊的生态系统提出了一种水体环境DNA的采样方法，为喀斯特高原湖泊开展生物多样性调查提供了一种准确高效且经济的调查采样方法。

技术领域

本发明涉及水样采集技术领域，具体为一种喀斯特高原湖泊水环境DNA样品的现场采集方法。

背景技术

喀斯特湖泊，又称“岩溶湖”，由喀斯特作用（岩溶作用）所形成的洼地积水而成的湖泊，是侵蚀湖的一种。它可以是由具有溶蚀性的水对可溶岩进行溶蚀作用后，形成了洼地积水，也可以是由地下水溶解土壤中的盐类引起塌陷而生成塌陷湖。喀斯特湖主要靠地下水供水，水量一般较稳定。喀斯特水文系统是一个发育于溶岩含水层中独特的水文系统，它与其他水文系统相比具有高度的敏感性和脆弱性（袁道先,2001）。

高原上同样也分布着喀斯特湖泊，喀斯特高原湖泊鱼类生物多样性丰富。近现代以来，随着城镇化和工业化的进行，我国西南喀斯特地区生态环境逐渐遭到破坏，这也造成了这些区域成为濒危物种最集中的地区之一（王波等，2018）。传统鱼类多样性的调查研究方法主要靠垂钓、网捕、电击等采集方法，对生物多样性的保护造成不同程度的入侵和破坏，且由于喀斯特高原湖泊构造复杂往往导致采样耗时费力，难度极大，相关研究工作进展缓慢。环境DNA技术具有灵敏度高、效率高、成本低等特点，该项技术近几年来已成为开展生物多样性研究的重要方法，利用环境DNA技术可以开展高原喀斯特湖泊的鱼类多样性的研究工作，而且满足当前生物多样性资源保护的科学需求。但对于目前环境DNA采样的技术方法而言，环境DNA的样品仍然存在着交叉污染或外源DNA污染和DNA降解的风险，这会严重影响实验的严谨性和分析结果的准确性。

所以我们提出了一种喀斯特高原湖泊水环境DNA样品的现场采集方法，以便于解决上述中提出的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种喀斯特高原湖泊水环境DNA样品的现场采集方法，以解决上述背景技术提出的目前市场上的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种喀斯特高原湖泊水环境DNA样品的现场采集方法，包括以下步骤：

第一步，工作人员在采样前须佩戴一次性无菌手套，在采样点充分润洗采水器和塑料桶3~5次；

第二步，用采水器采集水样并倒入润洗过的塑料桶内，装2 L水于无菌广口瓶中，随后立即进行低温避光保存处理；

第三步，使用隔膜真空泵和砂芯玻璃过滤装置抽滤水样，采用滤膜富集eDNA，进行抽滤工作之前须用1%次氯酸溶液对抽滤操作工作台和周围3 m内的空气进行消毒，随后进行真空抽滤；

第四步，抽滤工作完成后，水样中的eDNA富集于滤膜上，用镊子将滤膜卷起置于无菌离心管中在-20℃条件下保存。

优选的，所述第二步中，若水深≤5 m，采集深度为1 m的水样；若水深大于5 m且小于10 m，采集深度为1 m和5 m水深的水样于桶内混合待用；若水深≥10 m，分别采集1 m、5m、10 m水深水样混合待用。

优选的，所述第四步中，每一瓶样品抽滤结束之后均用蒸馏水清洗砂芯玻璃并更换一次性无菌手套，设置1个空白对照。