[发明专利]鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法

权利要求书

1.鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：步骤一，鸡蛋过敏患者血清样本收集；步骤二，鸡蛋蛋清过敏原提取制备；步骤三，鸡蛋过敏原蛋白表达制备；步骤四，免疫斑点实验；步骤五，ELISA试验检测患者血清与过敏原的反应；步骤六，点刺液制备；其特征在于：

其中在上述步骤一中，鸡蛋过敏患者进行血清样本收集；

其中在上述步骤二中，鸡蛋蛋清过敏原提取制备步骤如下：

1)取鸡蛋一个，收集蛋清，纱布滤去粘稠物，取适量清液加入等体积的PBS，调pH至6.0，4C静置过夜后8000rpm离心40min分离上清和沉淀，沉淀用PBS复溶，取上清调pH至4.0，在20ml的上清中加入30ml饱和AS溶液，使AS终浓度达到60％，之后搅拌30min，37C水浴30min后4C盐析过夜，8000rpm离心30min分离上清和沉淀；沉淀用0.01M PBS复溶后装入MWCO为l0 kD超滤，然后置于透析袋于PBS中透析除盐；

2)蛋白粗提物重新悬浮在缓冲液2(0.1％triton-100,20mM Tris-HCl pH 8.0)中，在4℃下与10倍缓冲液2透析10小时；4次透析后，样品用0.45μm孔径过滤器过滤，加载到色谱柱(GE Healthcare)，用Tris缓冲液洗脱，线性梯度为0-0.8M NaCl在120mL中洗脱；收集含有14.4kDa蛋白的峰，随后确认为牛奶过敏原乳清蛋白，SDS-PAGE测定洗脱蛋白纯度；

其中在上述步骤三中，鸡蛋过敏原蛋白表达制备步骤如下：

1)使用基因组DNA纯化试剂盒提取鸡蛋清基因组DNA；向蛋清中加入蛋白质沉淀溶液，混合物离心，上清转移到含有异丙醇的清洁管中；经过温和的混合后，将溶液离心，除去上清，然后加入70％的乙醇；然后离心除去乙醇，用65℃预热的DNA复水化溶液重新悬浮DNA球团引物设计基于牛奶基因组序列，测定基因组DNA浓度；

2)基于鸡蛋基因组DNA序列，设计引物对基因序列进行扩增，对PCR产物进行测序加以验证；

3)蛋清蛋白过敏原表达纯化：将含有上述蛋白基因序列的质粒，转化大肠杆菌进行蛋白表达，将菌体超声后，取沉淀溶解后，离心，取上清透析至pH＝9.5的Tris溶液中获取蛋白；SDS/PAGE进行分析确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况，收集目的蛋白；

其中在上述步骤四中，将提取以及纯化的蛋清蛋白与患者血清、阴性对照血清进行免疫斑点实验，过敏原在硝化纤维膜上风干后，封闭和吐温清洗；将20份阳性血清样本和1份阴性血清样本稀释后与膜共同孵育后，加入山羊抗人IgE抗体孵育，最后加入HRP-驴抗山羊IgG抗体后使用ECL化学发光检测器(Bio-Rad,USA)显色；

其中在上述步骤五中，将提取以及纯化的蛋清蛋白包被在ELISA板上过夜后进行ELISA检测，具体方法同步骤四；

其中在上述步骤六中，将纯化的过敏原超滤后去除小分子非致敏成分，除菌过滤后测算浓度，并同浸泡后脱脂密封保存。

2.根据权利要求1所述的鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述步骤一中，患者纳入标准：本项目拟招募20名鸡蛋过敏患者；入选标准具体如下：1)签署书面知情同意；2)18岁≤年龄＜60岁；3)无自身免疫性疾病及肿瘤性疾病，无长期口服激素或免疫抑制剂；4)临床诊断鸡蛋过敏。

3.根据权利要求1所述的鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述步骤一中，对获取的血清样本行鸡蛋过敏原IgE检测，IgE值低于0.35KuA/L为阴性，阳性的样本进一步用于后续研究。

4.根据权利要求1所述的鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述步骤二2)中，用二维液相色谱多级质谱仪再次验证蛋白的分子量，分析蛋白的表达序列。

5.根据权利要求1所述的鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述步骤五中，设置非鸡蛋过敏患者血清与鸡蛋过敏原做交叉免疫对照，以评估该方法的可靠性。

6.根据权利要求1所述的鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述步骤六中，在制备点刺液时，根据需要的浓度用甘油进行稀释。