[发明专利]一种毛竹愈伤组织悬浮体系的建立方法

说明书

本发明公开了一种毛竹愈伤组织悬浮体系的建立方法，包括1）毛竹未成熟种子消毒后取出种胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织；2）将诱导获得的毛竹愈伤组织进行增殖培养，将步骤1）的愈伤组织挑选淡黄色松散型愈伤组织建立毛竹愈伤组织悬浮体系。本发明方法可有效提高毛竹愈伤组织增殖率，且状态相对一致，建立稳定高效的悬浮体系，可为毛竹的再生体系、瞬时转化体系及农杆菌介导的稳定遗传转化体系的建立奠定基础，还可为毛竹等散生竹种的遗传改良提供帮助。

技术领域

本发明属于植物快繁技术领域，具体涉及一种毛竹愈伤组织悬浮体系的建立方法。

背景技术

毛竹（ Phyllostachys edulis），禾本科（Poaceae）竹亚科（Bambusoideae）刚竹属（ Phyllostachys）多年生草本植物，单轴散生，集食用、材用、观赏等多种用途于一体，具有极高的经济价值和生态效益。而当前毛竹愈伤组织分化率低、周期长，再生体系不稳定等问题，为散生竹的转基因工作带来了巨大困难。

而大量稳定增殖的愈伤组织是毛竹再生体系及遗传转化体系建立的基础。植物细胞悬浮培养技术是植物组织培养中的一种重要方法，即将植物细胞置于液体培养基中震荡培养。利用植物细胞悬浮培养体系可在较短时间内获得大量且状态均一的植物细胞，因此，细胞悬浮培养体系被广泛应用于体细胞杂交、基因工程以及次生代谢物培养等方面。因此，借助悬浮培养技术可获得大量的、状态相对一致的毛竹愈伤组织，可为毛竹再生体系奠定一定基础，为解决遗传转化体系建立提供一定保障。本申请从摇床转速、初始接种量、培养液pH、NH₄⁺等方面调整毛竹悬浮培养的外部环境因素和培养条件，确定毛竹愈伤组织最适宜的生长环境，以期建立毛竹愈伤组织悬浮体系。然而，目前未见有针对毛竹进行愈伤组织悬浮体系培养的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种毛竹愈伤组织悬浮体系的建立方法，以短时间内稳定获得大量且状态相对一致的愈伤组织，为毛竹的再生及遗传转化体系的建立奠定基础。

具体通过以下技术方案加以实现：

毛竹愈伤组织悬浮体系的建立方法，包括以下步骤：

1）毛竹未成熟种子消毒后取出种胚，将其接种于愈伤组织诱导培养基中培养，获得毛竹愈伤组织；

2）将诱导获得的毛竹愈伤组织进行增殖培养，选取淡黄色松散型愈伤组织转移到相应的液体培养基中于恒温摇床中黑暗培养，稳定继代培养后建立毛竹愈伤组织悬浮体系。

进一步地，步骤1）中的毛竹种子的处理过程为：将未成熟毛竹种子剥去外壳→流水冲洗2-4h→75%酒精消毒1min→1.5%次氯酸钠溶液真空抽滤消毒18min→无菌水冲洗4-5次，在体视显微镜下剥离毛竹未成熟种胚将其接种于毛竹愈伤组织诱导培养基中黑暗培养。

进一步地，步骤1）中诱导培养基选用WPM基础培养基，pH为5.8，该培养基中添加了0.1mg/L TDZ（Thidiazuron，噻苯隆，简称TDZ）、4.0mg/L 2,4-D（2,4-Dicholrophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸，简称2,4-D）、0.5mg/L BA（6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤，简称BA）、15g/L蔗糖、5g/L麦芽糖及占培养基总量0.36%的gelrite。

进一步地，步骤2）中增殖培养所选用的培养基选用为WPM基础培养基，pH为5.8，该培养基中添加了0.1mg/L TDZ、2mg/L 2，4-D、0.5mg/L BA、15g/L 蔗糖和 5g/L 麦芽糖及占培养基总量0.36%的gelrite。

进一步地，步骤2）中用于接种的愈伤组织为从步骤1）获得的愈伤组织中挑选长势良好、淡黄色、质地疏松的愈伤组织。