[发明专利]7-DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌及其构建与应用

说明书

本发明涉及一种7‑DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌株，及其构建方法和应用。本发明构建了一株可向胞外高效转运7‑DHC的重组S.cerevisiae菌株sc13，利用其进行500mL摇瓶双相发酵时，7‑DHC总产量达到28.189mg/g(分泌量11.701mg/g)，相较于对照sc1菌株，7‑DHC总产量提升14.54倍，胞外总分泌量提升13.77倍，其中胞外7‑DHC的分泌产量占比41.51％。由本发明构建的重组菌株具有更强的外分泌能力和更高的产量，对7‑DHC的合成以及简化7‑DHC的分离提取提供了指导思路，具有广阔的应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种7-DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌株，及其构建方法和应用。

(二)背景技术

7-脱氢胆固醇(7-dehydrocholesterol，7-DHC)具有多种生物学功能，在紫外照射下，能直接转化成维生素D3，对维持骨骼的钙平衡、保护骨骼至关重要。另外，7-DHC参与高脂血症的治疗，高浓度的7-DHC的积累，有助于预防高血脂症。由于具有多种生物学活性，7-DHC在食品、制药等行业都有着广泛的应用。但是7-DHC的结构复杂，来源受限，主要通过羊毛脂提取和半化学合成获得，该路线资源消耗较大、提取及合成效率较低。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种模式可食用菌具有麦角固醇的天然合成途径，合成涉及约30种酶，整个途径包括甲羟戊酸生物合成，焦磷酸法尼酯生物合成和麦角甾醇生物合成三个模块。且酿酒酵母生长周期短，发酵能力强，具有完备的遗传操作系统，是甾醇类化合物从头合成的理想底盘。目前主流的策略是利用代谢工程改造策略，通过敲除erg5/6基因，并异源表达C-24还原酶DHCR24重构麦角固醇途径，实现7-DHC的累积。目前，通过合成路径上7-DHC的关键限制步骤的强化，结合基于模块化整合及细胞器理性改造策略提升胞内蓄积能力等策略，近年来，GUO等进一步筛选了DHCR24的来源，在增强这些基因表达的基础上敲除了内质网膜相关基因PAH1，发现这些都有利于固醇的合成。Lisha Qiu等人在工作中提到ΔGDH1，不仅能提高7-DHC的滴度，还能增强菌株的生长速度。为了优化碳代谢流，他们使用CRISPRi技术降低ERG6的表达。Wenqian Wei等人关注角鲨烯后通路，注意到有一种ERG2表达的抑制剂，即MOT3。在去除对MOT3的抑制后，CTT1被整合到基因组中，保护细胞免受过氧化氢的伤害，最终改善了固醇的合成，显著提升了7-DHC的合成能力，结合酵母的高密度培养工艺，实现了3g/L以上的发酵水平，已成为依赖传统提取工艺的重要替代路径，具有较好的市场应用前景。

随着酯类物质在细胞内转运存储机制探究的深入，多种内源性脂类运输蛋白被依次解析，可通过非囊泡转运的途径结合甾醇定向转运蛋白实现出胞分泌。胆固醇等甾醇在真核细胞中分布不均匀，这种现象在质膜(PM)中表现最为显著，质膜中含有60-80％的细胞游离胆固醇，在PM中约含有35-45％的脂质。这是细胞内稳态的一个关键方面，因为膜内固醇浓度的改变可能会极大地改变膜的物理性质(如流动性)，影响信号转导、膜运输或完整蛋白的功能等不同过程。越来越清楚的是，维持这种细胞内甾醇的分布依赖于一个严格控制的合成、运输和储存系统。病原体相关酵母(PRY)蛋白，作为一类甾醇结合蛋白，酿酒酵母中具有三个Pry家族成员，Roger Schneiter等人研究表明Pry1和Pry2参与甾醇转运分泌，而Pry3是一种与细胞壁结合的蛋白。此外，酿酒酵母含有另一种内源性甾醇转运机制，通过定位在晚期核内和溶酶体上的NPC2和NCR1。基于DHE的活细胞成像实验，发现NCR1和NPC2是将甾醇运送到液泡膜所必需的，尤其是当细胞处于饥饿状态时。此外，在众多的酯质交换蛋白中，还包括细胞质膜甾醇转运蛋白，如Aus1p与Pdr11p等，被广泛应用于疏水性酯类化合物如胡萝卜素的出胞转运。此外，在酵母细胞中，锚定在细胞膜接触位点的脂交换家族蛋白Lam1p-Lam6p具有酯交换结构域，其输水性口袋能够特异性识别多种甾醇化合物，在介导甾醇非囊泡依赖的物质转运过程中也起到重要的功能。近期，Sokolov等综述了麦角甾醇在酿酒酵母细胞中的合成及转运路径的转换过程，突出了Oshp与Lamp在促进甾醇非囊泡转运途径的重要功能。