[发明专利]靶向SARS-CoV-2 RBD与其受体ACE2共享表位的驼源纳米抗体

说明书

本发明提供靶向SARS‑CoV‑2RBD与其受体ACE2共享表位的驼源纳米抗体，所述纳米抗体或其抗原结合片段与SARS‑CoV‑2RBD的关键位点F486、Q493和S494同时结合。本发明筛选纯化得到的纳米抗体VHH5‑05，不仅只对展示野生型SARS‑CoV‑2RBD的噬菌体表现出了强的结合能力，同时对Beta突变株RBD和Delta突变株RBD的噬菌体也表现出一定结合能力。

技术领域

本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种靶向SARS-CoV-2 RBD与其受体ACE2共享表位的驼源纳米抗体，以及该抗体在预防和/或治疗与SARS-CoV-2病毒感染相关的疾病中的用途。

背景技术

SARS-CoV-2是单链正义RNA包膜病毒，其膜表面表达有众多的刺突蛋白(spikeprotein，S-protein，简称S蛋白)，由此形成了SARS-CoV-2的花冠外观。S蛋白实际为同源三聚体蛋白，每个蛋白单体包含一个S1亚基(14–685aa)与一个S2亚基(686–1273aa)。S蛋白可识别并结合细胞膜表面的血管紧张素转化酶2受体(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)，并且在经过细胞表面的丝氨酸蛋白酶TMPRSS2的切割处理后，介导病毒包膜与细胞膜融合，促使病毒RNA基因组进入宿主细胞。这其中S1亚基的受体结合结构域(Receptor-binding domain，RBD)是研究SARS-CoV-2与ACE2受体结合以及抗体识别的关键区域，被认为是迄今为止最有效的抗SARS-CoV-2中和抗体(neutralizing antibodies,NAbs)的靶标。

中和抗体疗法是人类应对重大公共卫生危机过程中的有利武器之一，因其能达到治疗加预防的双重效果而备受关注和期待。中和抗体发挥作用往往是通过与病毒RBD结合，进而阻止病毒吸附于ACE2受体，使其不能穿入胞内进行复制增殖，此外中和抗体与病毒形成免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除。

驼源免疫球蛋白的单域抗体(single domain antibody，sdAb)是一种天然缺失轻链的抗体，只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区。单域抗体通过其重链上可变区结合抗原，该可变区可以单独稳定地在体外存在，被称为重链可变区单域抗体(variabledomain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)或者纳米抗体(nanobody，Nb)，分子量为12-15千道尔顿(KDa)，是目前已知的能与抗原结合的最小片段，相比传统的单抗(150KDa)更进一步具有多个特征，例如存在更多的可获得表位、相对较低的生产成本、更高的组织穿透力、在原核表达系统中也更易于生产等。

发明内容

在本发明中利用噬菌体展示技术进行纳米抗体筛选，该技术利用基因工程方法，将外源性基因片段插入到噬菌体的基因组中，使其编码的蛋白或多肽与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白，得以展示于噬菌体表面。被展示的蛋白可以保持相对的空间结构和生物活性，因而以靶蛋白为“鱼饵”钓出与其结合的目的蛋白，可达到对噬菌体库的筛选。

基于噬菌体展示的方法、纳米抗体的优良生物特性及RBD与ACE2结合介导病毒进入宿主细胞的基本原理，本发明是利用构建的噬菌体纳米抗体免疫文库，以野生型SARS-CoV-2 RBD(记为SARS-CoV-2 RBD WT)为靶标抗原，采用RBD-ACE2竞争淘选的方法淘筛纳米抗体，并对筛选得到的VHH进行表达和鉴定，针对SARS-CoV-2 RBD重组蛋白特异性结合的高亲和力纳米抗体。