[发明专利]一种评估致病力强度的报告体系

权利要求书

1.一种评估致病力强度的报告体系，通过如下步骤构建：首先构建青枯菌OE1-1的ΔphcB突变体OE1-1-dphcB，接着将phcA的直接转录靶点xpsR的启动子区域与编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌报告基因lacZ分别连接到pUC18-mini-Tn7T-Gm质粒上，通过电激转入OE1-1-dphcB后，利用PCR反应筛选构建成功的菌株，即为报告菌株。

2.根据权利要求1所述的一种评估致病力强度的报告体系，其特征在于，通过如下步骤构建：

步骤1，青枯菌OE1-1的ΔphcB突变体构建：PCR反应扩增出phcB左右各500bp的序列并融合，连接至PBLUESCRIPT II KS+质粒载体上，通过HindIII和BamHI双酶切获得所需片段后连接至pK18-Km质粒载体，得到连接正确的载体后转入E.coli S17-1菌株中，通过接合转移的方式将连接正确的pK18-Km质粒转入青枯菌中，筛选出ΔphcB突变株；

步骤2，pUC18-Tn7-xpsR-lacZ-Gm质粒的构建：PCR反应扩增出phcA的直接转录靶点xpsR的启动子区域并连接至PBLUESCRIPT II KS+质粒载体上，通过HindIII和BamHI双酶切获得所需片段后连接至pUC18-mini-Tn7T-Gm质粒载体，随后对该载体和含有编码β-半乳糖苷酶的报告基因lacZ的质粒lacZYA分别进行KpnI单酶切，将lacZYA酶切产物与KpnI单酶切的pUC18-mini-Tn7T-Gm质粒载体相连，构建pUC18-Tn7-xpsR-lacZ-Gm质粒；

步骤3，xpsR-lacZ报告体系的构建：利用构建成功pUC18-Tn7-xpsR-lacZ-Gm质粒，通过含有转座酶pTNS2辅助质粒，利用电激法，将目的片段xpsR-lacZ定点插入在步骤1的ΔphcB突变株glmS基因下游的attTn7位点，利用含有25µg/mL庆大霉素的BG固体培养基筛选OE1-1-dphcB-xpsR-lacZ菌株。

3.根据权利要求2所述的一种评估致病力强度的报告体系，其特征在于，所述步骤1中，使用的青枯菌为青枯菌OE1-1。

4.根据权利要求2所述的一种评估致病力强度的报告体系，其特征在于，所述步骤1中，phcB基因的左侧臂引物如下：

phcB-A-F：CGATGACCATGACGTCAGAG；

phcB-A-R：CGATCATGGTGCGTGCGCTCGGTGCGAATTTGCCGGAGAC。

5.根据权利要求2或4所述的一种评估致病力强度的报告体系，其特征在于，所述步骤1中，phcB基因的右侧臂引物如下：

phcB-B-F：GTCTCCGGCAAATTCGCACCGAGCGCACGCACCATGATCG；

phcB-B-R：TGAACAGCGAGTGCACGATG。

6.根据权利要求2所述的一种评估致病力强度的报告体系，其特征在于，所述步骤2中，xpsR引物如下：

xpsR-F：CGCGAGGTACCGGGCCCAAG；

xpsR-R：TTCGGTAATTTCCCTCCGGA。